周丽桂谢清华巩淼淼张永斌∗师长宏∗

(1.广州中医药大学动物实验中心,广州 510405;2.空军军医大学实验动物中心,西安 710032;3.延安大学医学院,陕西 延安 716000)

前列腺癌(prostate cancer,PCa)是男性发病率居第二位的肿瘤,其死亡率位居第五位[1]。 早期的激素依赖性前列腺癌(hormone-dependent prostate cancer,HNPC) 经过雄激素剥夺疗法治疗(androgen deprivation therapy,ADT)后,大部分患者从中受益[2]。然而经过一段时间后,绝大多数PCa 患者病情会复发,进展为去势抵抗性PCa (castration-resistant prostate cancer,CRPC)[3],甚至转化为更为难治的神经内分泌 PCa (neuroendocrine prostate cancer,NEPC)[4]。 PCa 的高度异质性是造成其临床治疗效果不佳的重要原因。 因此,寻找广谱的、可用于不同临床阶段的药物对于PCa 的治疗研究具有重要意义。

藤黄酸(gambogic acid,GA)是从藤黄科植物藤黄树分泌的干燥树脂中提取的最主要成分,具有多种生物活性,如抗癌、抗氧化、抗炎等[5]。 大量研究表明,GA 可以抑制多种癌细胞的生长,包括慢性髓性白血病[6]、胰腺癌[7]、乳腺癌[8]、肝癌[9]、肺癌[10]等。 已有研究表明,GA 可诱导PTEN-/-/p53-/-前列腺癌细胞和LAPC-4 细胞的凋亡[11]以及抑制PC3细胞体外侵袭[12]和血管生成[13]。 然而,目前有关GA 对不同表型PCa 细胞的作用效果的研究报道较少。 因此,本研究旨在将GA 作用于雄激素受体(androgen receptor,AR)阳性(AR+)的具有HNPC特征的LNCaP 细胞、AR+的具有CRPC 特征的22RV1 细胞以及AR 阴性(AR-)的具有NEPC 特征的PC3 细胞,研究其对不同表型PCa 细胞是否具有广泛的抑制作用。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞

人PCa 细胞系LNCaP、22RV1、PC3 购自美国典型培养物保藏中心,培养基为含有10% FBS 和1%青霉素/链霉素的RPMI-1640,置于37℃5%CO2培养箱中培养。 待细胞密度达到80%~90%时,使用0.25%胰酶消化进行传代培养。

1.1.2 实验动物

SPF 级6 周龄雄性BALB/c 裸鼠18 只,体重24~26 g,购自成都药康生物科技有限公司[SCXK(川)2020-034],饲养于空军军医大学实验动物中心屏障设施内[SYXK(陕)2017-001],环境温度23℃~25℃,相对湿度40%~60%,12 h/12 h 昼夜交替,饮用水经高压灭菌处理,动物自由摄食和饮水。本研究通过空军军医大学实验动物福利伦理委员会审核(IACUC-20211205),遵循3R 原则。

1.2 主要试剂与仪器

藤黄酸(S2448)和恩杂鲁胺(S1250)购自美国Selleckchem 公司;一抗:AR 兔抗(ab108341)购自美国Abcam 公司,Cleaved caspase-3 兔抗(9661)和Bcl-2 鼠 抗( 15071) 购 自 美 国 Cell Signaling Technology 公司,β-actin 鼠抗(AT0001)购自美国Engibody 公司;二抗:山羊抗兔(E-AB-1003)购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司,山羊抗鼠(EF0001)购自山东思科捷生物技术有限公司;RPMI-1640(美国Sigma 公司);FBS 和0.25%胰酶(美国Gibco 公司);细胞增殖和毒性检测试剂盒(CCK8)和Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒(上海七海复泰生物科技有限公司);总RNA 提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司);逆转录试剂盒和实时荧光PCR 试剂盒(日本TaKaRa 公司);RIPA 裂解液(上海碧云天生物技术有限公司);BCA 蛋白检测试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司);蛋白酶抑制剂(北京索莱宝科技有限公司);SDS-PAGE 试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司);ECL 发光液(美国Millipore 公司)。 梯度PCR 仪(德国Eppendorf 公司);荧光定量PCR 仪(美国ABI 公司);流式细胞仪(贝克曼,美国BD 公司);CO2培养箱(德国Heraeus 公司);多功能成像仪(美国Syngene 公司);多功能微孔板检测仪(美国BioTek 公司);电泳仪(美国Bio-Rad 公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞增值和毒性实验

将人PCa 细胞LNCaP、22RV1、PC3 以5000 个细胞/孔的密度接种于96 孔板中,并在37℃ 5%CO2培养箱中孵育24 h。 待细胞贴壁后,分别用指定浓度的恩杂鲁胺(enzalu tamide, Enz)、GA 处理细胞48 h,DMSO(0.1%)和培养基分别作为载体和空白对照。 每孔加入10 μL CCK8 试剂后37℃5%CO2培养箱孵育2 h,然后在微孔板检测仪450 nm处读取吸光度值以测定细胞活力。

1.3.2 qRT-PCR

药物处理细胞24 h 后,使用总RNA 提取试剂盒分别提取各组细胞样本的总RNA,使用逆转录试剂盒将RNA 逆转录为cDNA,然后将各组样本的cDNA 进行实时荧光定量PCR。 引物序列如表1 所示,以β-actin为内参基因,根据公式2-ΔΔCT计算各组基因的相对表达量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3.3 Western blot

药物处理细胞24 h 后收集细胞,用含有蛋白酶抑制剂的RIPA 缓冲液裂解细胞。 使用BCA 蛋白检测试剂盒检测总蛋白浓度并按每孔20 μg 蛋白进行蛋白定量。 然后上样、电泳、转膜、封闭,分别加入一抗AR(1 ∶1000)、Cleaved caspase-3(1 ∶1000)、Bcl-2(1 ∶1000)和β-actin(1 ∶2000)4℃摇床过夜;TBST洗涤3 次后加入相应的二抗(山羊抗兔1 ∶4000、山羊抗鼠1 ∶4000)室温孵育2 h,显影并拍照保存。 采用Image J 图像分析软件进行灰度比分析。

1.3.4 流式细胞术检测细胞凋亡

药物处理细胞24 h 后收集各组细胞,分别用PBS 和buffer 溶液洗涤细胞后弃上清,加入FITC 溶液室温避光孵育15 min,加入PI 溶液4℃孵育5 min,30 min 内检测细胞凋亡情况。

1.3.5 异种移植模型

将5×106个PC3 细胞接种于裸鼠右侧背部皮下,待肿瘤体积长至30~100 mm3时,将荷瘤鼠随机分为3 组:Control 组、Enz 组和GA 组,每组6 只。 分别用载体(2% DMSO、40% PEG300、2% Tween 80 和56% ddH2O,ip,2 d 1 次)、Enz(30 mg/kg,ig,2 d 1 次)和GA(3 mg/ kg,ip,2 d 1 次)处理荷瘤鼠2周,药物处理期间测量小鼠肿瘤体积变化。 通过公式:(长×宽2)/2 计算肿瘤体积。 2 周后肿瘤异种移植物被移除、称重、固定、冻存。

1.4 统计学方法

使用SPSS 18.0 软件完成数据分析。结果以平均数±标准差(±s)表示符合正态分布的计量资料。对符合正态分布的多组资料采用单因素方差分析进行比较。 若满足方差齐性则采用Dunnett-t检验或LSD 检验进行组间比较,若方差不齐则采用Dunnett’s T3 检验进行组间比较。P<0.05 被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 GA 抑制不同表型PCa 细胞的增殖和活性

为探索GA 对不同表型PCa 细胞生长的影响,将代表不同PCa 表型的LNCaP、22RV1、PC3 细胞用不同浓度的GA 处理48 h,并选用临床一线治疗药物Enz 进行对比。 如图1A 所示,Enz 作用于PCa 细胞具有明显的选择性,对AR+的HNPC 细胞LNCaP明显有效,IC50值为11.15 μmol/L,而22RV1 和PC3细胞均对Enz 具有耐药性,IC50值分别为67.02、116.9 μmol/L。 与Enz 相比,GA 对PCa 细胞的作用没有选择性,它可以广泛抑制LNCaP、22RV1、PC3 3 种不同表型PCa 细胞的增殖,且起效浓度比较低,IC50值分别为0.49、0.58、0.64 μmol/L。 为进一步评价GA 对PCa 细胞增殖的抑制效果,根据GA 对PCa 细胞的IC50值结果选取0、0.25、0.5、0.75 μmol/L 浓度的GA 分别处理细胞24 h,然后检测细胞增殖标志物Ki67 的表达水平。结果如图1B 所示,GA 以剂量依赖性方式抑制不同细胞Ki67 的表达(P<0.05)。 以上结果表明了GA 可以有效抑制不同表型PCa 细胞的增殖和活性。

2.2 GA 抑制PCa 细胞AR 的表达

AR 一直是临床治疗PCa 患者的主要治疗靶点,目前提出的CRPC 分子机制大部分主要是围绕着AR 表达的改变和AR 信号传导的失调[14]。 为明确GA 对PCa 细胞AR 表达的影响,将0、0.25、0.5、0.75 μmol/L 的GA 分别作用于AR+的LNCaP 和22RV1 细胞,使用qRT-PCR、Western blot 分别从mRNA、蛋白水平检测给药后AR 的表达情况。结果如图2 所示,与对照组相比,0.25 μmol/L 的GA 对LNCaP、22RV1 细胞AR 的表达基本没有影响,无统计学差异;但随着给药浓度的提高,AR 在mRNA 和蛋白层面的表达逐渐降低,具有统计学差异(P<0.05)。 以上结果表明了GA 可在mRNA 和蛋白水平抑制PCa 细胞AR 的表达。

注:以β-actin 为内参基因,以0 μmol/L GA 组为对照组。 A:各个浓度的复孔数量n= 6;B:各组的重复次数n= 3。 与对照组相比,∗P<0.05,∗∗P<0.01,∗∗∗P<0.001。图1 GA 抑制不同表型PCa 细胞的增殖和活性Note. β-actin was used as reference gene, and 0 μmol/L GA group was used as control group. A, Number of multiple pores at each concentration,n=6. B, Number of repeats in each group, n=3. Compared with control group, ∗P<0.05, ∗∗P<0.01, ∗∗∗P<0.001.Figure 1 GA inhibited the proliferation and activity of PCa cells with different phenotypes

2.3 GA 诱导22RV1、PC3 细胞的凋亡

为探究GA 诱导PCa 细胞死亡的能力,我们将0、0.25、0.5、0.75 μmol/L 的GA 作用于22RV1、PC3 细胞24 h 后,使用Annexin V-PI 双染法通过流式细胞仪检测细胞凋亡的情况。 我们发现0~0.75 μmol/L 的GA 作用于PC3 细胞后,细胞未见有明显的凋亡趋势,因此我们进一步将GA 作用于PC3 细胞的浓度调整为0、0.75、1.0、1.25 μmol/L。结果如图3A 所示,随着GA 作用浓度的升高,Annexin+PI-和Annexin+PI+细胞数量逐渐增加,表明PCa 细胞呈剂量依赖性凋亡。 我们进一步检测GA 处理后PCa 细胞蛋白水平凋亡通路核心分子Cleaved caspase-3 和Bcl-2 的表达。结果如图3B 所示,随着GA 浓度的提高,PCa 细胞Cleaved caspase-3 的表达显著增强(P<0.001),抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达明显下降(P<0.001)。 这些结果表明GA 可通过影响Cleaved caspase-3 和Bcl-2 的表达诱导PCa 细胞凋亡。

2.4 GA 抑制PCa 细胞PC3 体内的生长

有研究表明,在动物体内以每2 d 1 次腹腔注射4 mg/kg 的GA 是安全的[15],并以3 mg/kg 每2 d 1 次腹腔注射GA 对雄性裸鼠的体重变化基本没有影响[16]。 因此,对于GA 我们选取3 mg/kg 以每2 d 1 次腹腔注射的方式进行给药。 同时,我们以Enz作为阳性对照结果与GA 的作用效果进行对比。Weyer-Czernilofsky 等[17]发 现 单 独 使 用 Enz 30 mg/kg可抑制PC3 异种移植肿瘤的生长且小鼠体重保持平稳,因此对于Enz 我们选取30 mg/kg 每2 d 1 次灌胃的方式进行给药。 整个实验过程中各组小鼠的各项体征保持相对稳定,实验结果如图4 所示,GA 显著抑制了肿瘤的生长。 与Control 组相比,Enz组的肿瘤重量和肿瘤体积虽然有所降低,但无统计学差异,而GA 组的肿瘤重量和肿瘤体积显著降低(P<0.01)。 与En 组相比,GA 组对PC3 异种移植肿瘤的抑制效果更加明显。

注:以β-actin 为内参基因和管家蛋白,以0 μmol/L GA 组为对照组。 与对照组相比,∗P<0.05,∗∗P<0.01,∗∗∗P<0.001,∗∗∗∗P<0.0001。图2 GA 在mRNA、蛋白层面抑制PCa 细胞AR 的表达(n=3)Note. β-actin was used as reference gene and housekeeping protein,and 0 μmol/L GA group was used as control group. Compared with control group, ∗P<0.05, ∗∗P<0.01, ∗∗∗P<0.001, ∗∗∗∗P<0.0001.Figure 2 GA inhibited the expression of AR in PCa cells at mRNA and protein levels

3 讨论

藤黄是一味具有消肿、攻毒、祛腐敛疮、止血、杀虫等功效的中药本草,中医古籍《不药良方》和《救生苦海》评价其可“治一切无名肿毒”。 GA 是藤黄中的主要活性成分,现代医学已有报道GA 对人类多种癌症具有抗肿瘤活性,但GA 对高度异质性的PCa 的研究较少。 Enz 属于AR 拮抗剂,是临床上治疗已扩散或复发的晚期CRPC 的一线治疗药物,对PCa 患者具有一定的选择性,且随着疾病的进展,获得性耐药的产生限制了Enz 的治疗效果[18]。 本研究结果发现,与对PCa 细胞具有选择性的Enz 相比,GA 对分别代表了PCa 进展过程中激素依赖性、去势抵抗性和神经内分泌性3 个不同阶段的LNCaP、22RV1、PC3 细胞均有明显的抑制作用,并以剂量依赖性方式降低了PCa 细胞的增殖和活性,表明GA 对PCa 细胞的增殖具有抑制作用。有研究表明,GA 对PTEN-/-/p53-/-PCa 细胞同样具有很好的抑制作用[11],然而该结果缺乏体内实验的研究。 在本研究的体内实验中,Enz 在30 mg/kg 的剂量下对难治性PC3 异种移植物具有一定的抑制效果,而GA 组在3 mg/kg 的剂量下已显著性抑制了肿瘤的生长,相比较Enz 更具有明显的抑制作用。上述结果表明GA 有望成为广谱应用于不同表型PCa 的理想治疗药物。

注:以β-actin 为管家蛋白,以0 μmol/L GA 组为对照组。 与对照组相比,∗∗∗P<0.001,∗∗∗∗P<0.0001。图3 GA 诱导PCa 细胞凋亡(n=3)Note. β-actin was used as housekeeping protein and 0 μmol/L GA group was used as control group. Compared with control group, ∗∗∗P<0.001, ∗∗∗∗P<0.0001.Figure 3 GA induced apoptosis of PCa cells

注:与Control 组相比,∗∗P<0.01;与Enz 组相比,#P<0.05。图4 GA 抑制PC3 异种移植物体内的生长(n=6)Note. Compared with Control group, ∗∗P<0.01. Compared with Enz group, #P<0.05.Figure 4 GA inhibited the growth of PC3 xenograft in vivo

此外,本研究发现GA 可通过上调Cleaved caspase-3 蛋白的表达和下调Bcl-2 蛋白的表达促进PCa 细胞的凋亡,这与Shi 等[6]的研究结果一致,明确了GA 诱导PCa 细胞凋亡与线粒体依赖性途径有关。 AR 信号在PCa 的发生发展过程中具有十分重要的作用,是PCa 的主要驱动因子和治疗靶点[19]。临床ADT 处理和竞争性AR 抑制剂治疗后PCa 进展产生的CRPC,其主要原因也是AR 信号恢复的结果[20]。 本研究发现无论是代表HNPC 还是CRPC的PCa 细胞,GA 均可在mRNA 水平和蛋白水平抑制细胞AR 的表达,说明GA 对PCa 的治疗效果与调控AR 的水平密切相关。 藤黄具有一定的毒性作用,但GA 可能具有独特的选择性抗肿瘤机制。 与正常细胞相比,癌细胞对GA 的治疗更为敏感[21]。本研究参照已有的文献报道,选取3 mg/kg 的安全剂量,每2 d 1 次腹腔注射,取得了良好的治疗效果,证实了GA 的有效性[16]。 多项研究表明,GA 具有很好的协同作用,毒副作用低,可逆转多种癌症对临床药物产生的耐药性[22-24],因此GA 可能是癌细胞化学增敏的一种新药。 研究报道,GA 与Enz或多西他赛在体外联合使用对抑制LuCaP136 PDX衍生的类器官培养物的生长具有良好的协同作用[25],但GA 和Enz 在体内联合使用的效果尚不明确。 因此,后续可以在体内实验中验证GA 与Enz或其他临床药物联合使用对PCa 的治疗效果。

综上所述,GA 可通过调控Cleaved caspase-3 和Bcl-2 的表达促进PCa 细胞的凋亡进而抑制肿瘤细胞的生长,并抑制PCa 细胞AR 的表达。 与临床一线治疗药物Enz 相比,GA 对不同临床特征的PCa细胞均有治疗效果,能广泛抑制PCa 细胞的增殖和活性,且起效剂量较低。