游旭军 袁少英 何超拔 李创鹏 成杰辉 张艳玲 王 涛田 林罗翠文覃 湛王友炼

（1.深圳市宝安区中医院男科，广东 深圳 518133；2.广东省中医院珠海医院男科，广东 珠海 519015；3.广东省中医院珠海医院内科，广东 珠海 519015；4.广东省中医院珠海医院治未病中心，广东 珠海 519015；5.广东省中医院珠海医院外科，广东 珠海 519015）

自从2019年底武汉市新型冠状病毒肺炎（COVID-19）疫情暴发以来，中医中药发挥着重要的预防与治疗作用[1，2]。为了尽早地发现和控制病毒的传播及发挥中医药预防优势[3]，本研究基于中医“未病先防”理论对2020年2月8日被隔离于广东省珠海市望海楼酒店的67名新冠肺炎密切接触者进行了中医治未病预防处方干预，通过数据挖掘的形式提炼出核心用药组合，及运用网络药理学方法预测中医治未病预防处方中核心用药组合预防COVID-19的现代药理学机制。旨在为中医药预防COVID-19的研究提供进一步科学与实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 研究对象为2020年2月8日被隔离于广东省珠海市望海楼酒店的接受中医治未病预防处方干预67例新冠肺炎密切接触者。

1.2 纳入标准（1）寒湿内伏证：平素体质偏寒，畏寒怕冷、精神不振手足不温、喜热饮食、纳呆便溏等，感冒初起易鼻塞、打喷嚏、流清鼻涕、轻微发热、头痛、颈项发紧等。（2）燥热内伏证：平素体质偏热，脸色偏红，易口干、咽痛，喜冷食，大便干结，感冒初起时易咽喉红肿疼痛、鼻流黄涕、咳嗽痰黏或黄等。（3）平调寒热证：平素身体健康，无明显寒热偏颇[4]。

1.3 处方数据录入及分析 将符合上述纳入标准的67例密切接触者的预防处方，录入到中医传承辅助平台（V2.5）的“临床采集系统”中，在“数据分析系统”中设置支持度20、置信度0.8的情况下进行网络化展示，提取出核心用药组合。

1.4 核心用药组合的活性成分的筛选 以口服生物利用度（Oral bioavail ability，OB）≥30%、类药性（Drug likeness，DL）≥0.18为限制条件进行筛选，得到治未病预防处方核心用药组合生物活性成分及靶基因。

1.5 新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的疾病靶点筛选 设置检索词为“novel coronavirus or COVID-19”，选择物种为“Homo sapiens”，通过Gene Cards数据库及OMIM数据库进行检索，筛选得到COVID-19的疾病靶点。

1.6 Gene ontology（GO）生物功能分析和KEGG Pathway富集 通过R语言程序及Per l语言程序将疾病靶点与药物靶点进行交集，绘制韦恩图，应用STRING网络构建共同靶点互作网络PPI，应用count.R插件获得共同蛋白靶点出现的频次，并对核心药物活性成分与COVID-19的共同靶点进行GO分析及KEGG Pathway富集分析，探索核心用药组合预防COVID-19的可能的生物功能及信号通路机制。

2 结果

2.1 药物频次及组方用药规律分析 对数据库中67例密切接触者的预防处方进行药物“频次统计”，共纳入药物51味，统计共622药次，并熵聚类挖掘出核心用药组合（金银花、连翘、芦根、甘草、茯苓、五爪龙、薏苡仁、白豆蔻），其网络化展示见图1。

图1 核心用药组合网络化展示

2.2 核心用药组合活性成分及靶点筛选 通过TCMSP数据库对核心用药组合8味中药的活性成分进行检索，其中金银花23个、连翘23个、芦根1个、甘草92个、茯苓15个、五爪龙20个、薏苡仁9个、白豆蔻12个，共得到195个生物活性成分纳入本次研究。对这些活性成分进行靶点预测，去重后获得靶点238个。

2.3 新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的疾病靶点筛选 通过检索Gene Cards数据库得到COVID-19的疾病治疗靶点，设置Relevance score≥0.1并删去重复靶点，共得到COVID-19疾病相关靶标共798个。

2.4 核心用药组合预防COVID-19的生物功能（GO）及KEGG通路富集分析 利用R语言软件对以上共同靶点进行GO功能分析，其中的生物过程主要涉及细胞因子受体结合、细胞因子活性、受体配体活性等。57个共同靶点主要分布Coronavirus disease-COVID-19、IL-17、TNF、PI3K-Akt、HIF-1 signaling pathway五条信号通路中，这提示核心用药组合可通过不同的代谢通路，多成分、多靶点相互调节来预防COVID-19。见图2。

图2 KEGG富集分析弦图

2.5 核心用药组合预防COVID-19的靶点筛选及互作网络构建 将798个COVID-19疾病靶点与药物活性成分作用靶点238个（含重复）应用R语言软件及Per l语言程序筛选出57个共同靶点；应用STRING数据平台“high confidence：0.7”的模式下构建互作网络（PPI），出现频次前三的是有VEGFA、IL6、STAT3等，可作为核心用药组合预防COVID-19的潜在靶点。见图3。

图3 核心用药组合与COVID-19共同靶点PPI图

3 讨论

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）为感受“疫疠”之邪而发生的一种急性传染病，归属于中医“疫毒”“瘟疫”等范畴[5]。中医对病原的认识，不唯重视“戾气”传染的致病物质，同时重视人体正气的内在因素，更以调动机体防御和调节免疫为主导思想，因此，在COVID-19疫情防治工作中，中医药在预防传染病提高免疫力方面具有重要作用[6-9]。在中药频次统计上，以补虚药、清热解毒药及化湿药为主，通过分析药物之间的关联性及相似性，从中提炼预防本病的核心药物组合（金银花、连翘、芦根、甘草、茯苓、五爪龙、薏苡仁、白豆蔻），可为临床预防COVID-19提供临床用药参考，但潜在机制仍需进一步探索。

采用TCMSP数据库筛选共获得核心药物组合的195个生物活性成分，并通过去重共获得238个药物作用靶点，为核心药物组合多成分、多靶点、多通路的预防机制提供参考。对核心药物组合与COVID-19的共同靶点进行交集，构建互作网络PPI，对网络分析后发现VEGFA、IL6、STAT3、CASP3、MAPK3等靶点是核心用药组合预防COVID-19的潜在主要靶点。研究表明，在COVID-19大流行期间抗VEGF方案可最大程度地减少患者和医护人员接触COVID-19的风险[10]，且COVID-19疾病炎症严重程度和并发症与VEGF-A水平的关系密切[11]。IL-6作为“细胞因子风暴”家族中的一员，可作为重症COVID-19患者的预后生物标志物[12]，且在COVID-19患者中IL-6炎性过程以及认知活动主要在甲状腺等内分泌腺体和中枢神经系统中起作用[13]。MAPK3是丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族成员之一，参与细胞分化、生长、免疫调节等多种细胞活动，研究显示其在病毒感染等相关内环境应激下可被激活[14]。Wang等[15]研究发现通过宿主细胞蛋白MAPK3可被抑制，从而抑制病毒发展。此外，有研究显示STAT3、CASP3参与COVID-19遗传变异，且在COVID-19易感性中被确定为高风险等位基因[16]。

本研究进行了生物功能（GO）分析及KEGG核心通路筛选。其中生物过程主要涉及细胞因子受体结合、细胞因子活性、受体配体活性、磷酸酶结合、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性等，这些生物过程在预防COVID-19中起到了关键作用，同时体现出核心用药组合多靶点、多成分预防COVID-19。通过基因富集分析，57个共同靶点主要富集到与病毒感染、炎症因子、氧化应激、血管坏死因子等相关的通路上，其主要的调控通路有AGE-RAGE、COVID-19、白介素-17、肿瘤坏死因子、PI3K-Akt、缺氧诱导因子-1、MAPK等涉及免疫调节、病毒和炎症等多条信号通路，体现了核心用药组合预防COVID-19机制与调节机体免疫应答、发挥抗炎、抗病毒相关[17]。基于上述核心药物组合（金银花、连翘、芦根、甘草、茯苓、五爪龙、薏苡仁、白豆蔻）预防COVID-19的网络药理学分析，体现出中医未病先防的潜在机制与调节机体免疫应答、炎症因子相关，但具体的分子及药效机制仍需要进一步实验验证。