徐亚军，赵龙飞 *，符 可，望子龙，秦丁梅，王子秋，许明晨，袁菲菲

（1.商丘师范学院 生物与食品学院 河南省特色微生物资源开发与应用工程研究中心，河南 商丘 476000；2.江南大学 生物工程学院 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡 214122）

伤力草，又名生力草，是河南东部常见的一类多年生草本植物，根生，茎光滑，叶片两面无毛，边缘锯齿，对生，叶柄长4～8 cm。花紫色或白色，总状花序，全株有香味。主要生长在河南东部，安徽亳州等地也有生长。河南东部及附近地区百姓常在端午节时用其治疗身体虚亏、过度劳累，国内外文献中关于此植物的报道相对较少，其药理作用和药用价值也鲜有报道。王利等[1]研究伤力草水煎剂对小白鼠免疫机能的影响的实验表明，伤力草水提液可提高小鼠脾脏和胸腺指数，有效提高小鼠的非特异性免疫功能。王利等[2]研究伤力草水煎液对肉仔鸡部分血清生化指标的影响发现，伤力草水煎液可有效降低血清总胆固醇、三酰甘油、血清葡萄糖、低密度脂蛋白的含量，显著提高血清高密度脂蛋白的含量。秦彩玲等[3]研究伤力草对动物免疫性能等方面影响，试验结果表明，添加适量的伤力草提取物可以提高产蛋鸡后期的产蛋性能、蛋品质和免疫功能，饲料里添加300 mg/kg伤力草提取物效果较好。

生物抑菌剂是天然生物中提取能抑制微生物生长的一类活性成分，一般来自动、植物提取物或微生物菌丝的物质，能有效抗菌防腐，与化学抑菌剂相比，生物抑菌剂更安全、更稳定。杨慧轩等[4]研究发现，乳酸菌凭借其天然的来源、提供可持续的保护作用，成为传统抑菌剂良好的替代品。随着国内外学者对天然植物研究的不断深入，其化学组成、活性成分、生理功能、结构与功能关系逐渐被发现并广泛应用于功能性食品和医药领域[5]。天然植物资源中主要化学成分有挥发油、多糖、酚类、生物碱、苷类、有机酸等，大量研究[6]表明，这些化学成分大多具有抑菌、增强免疫力、抗氧化等生理活性。张添菊等[7]研究表明，植物中抑菌活性物质在植物各组织（如种子、花、叶、茎、根、果等）均存在，可直接或提取后用于制备能够杀死或抑制病原生物的植物源抗菌消毒制剂，防治植物病害。植物源抗菌消毒剂的活性成分可有效降低环境污染[8-9]。因此，利用植物资源开发植物性抗菌物质成为现代农药研究的重要方向[10]。

大肠杆菌（Escherichia coli）在自然环境中普遍存在，但致病性大肠杆菌会使人类及动物染病[11]。大肠杆菌O157还会造成土壤和水资源污染，作为土壤中最为常见的致病菌，大肠杆菌O157主要通过粪肥进入土壤，且研究发现，土壤中的致病性大肠杆菌O157还会向地下转移，大肠杆菌便会通过土壤上种植的作物进入人类食物链，引发大规模的食物和水源污染[12]。因此，使用经过绿色处理的粪肥和保护灌溉水源对生态环境保护至关重要。为此，研究伤力草提取液对大肠杆菌的抑制作用，对有效控制大肠杆菌超标造成的食品污染及环境污染，研发污染食品的病原菌抑制剂或防腐剂具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大肠杆菌（Escherichia coli）：由国家自然科学基金（U1204301）课题组提供；伤力草：采自商丘市梁园区伤力草种植基地（E115°28′0.69″，N34°29′16.83″，海拔：42 m）。

LB液体培养基、牛肉膏-蛋白胨培养基：按参考文献[7]配制，所用试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

RE-52B旋转蒸发仪：上海书培实验设备有限公司；MLS-3750高压蒸汽灭菌器：南北仪器有限公司；ZHPW-250卧式恒温振荡培养箱：天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司；SHZ-Ⅲ循环水真空泵：上海亚荣生化仪器厂；HH-2数显恒温水浴锅：金坛市杰瑞尔电器有限公司；MEDIFRIGER BL-S台式高速冷冻离心机：西班牙MEDIFRIGER公司；V-5800PC分光光度计：上海精密仪器仪表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

取伤力草全株，将根、茎、叶、花各组织分离，清洗表面灰尘及泥垢后阴干，置于60 ℃烘箱中烘至恒质量，破碎机粉碎，备用。

1.3.2 伤力草浸提液的制备

称取伤力草粉末，在不同处理下提取液过滤，保留上层清液，将上清液置于离心机4 ℃、4 000 r/min离心15 min，保留上层清液，置于旋转蒸发仪65 ℃浓缩至一定浓度后，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.3.3 菌株活化及菌悬液的制备

大肠杆菌在37 ℃恒温培养24 h，用接种环挑一环大肠杆菌接种于LB液体培养基中，充分振荡，置于恒温振荡培养箱37 ℃培养24 h，离心弃上清，在无菌操作台上用蒸馏水将沉淀稀释至OD600nm≈0.1，置于4 ℃冰箱中短期保存备用。

1.3.4 抑菌实验方法

滤纸片药液浸泡法[13]：将直径准=0.6 cm的滤纸片121 ℃高压灭菌后冷却，浸泡在浸提液20 min，沥去滤纸片上残留浸提液，平贴在含菌培养基平板表面。每个培养皿有3～5片，培养基中央浸泡无菌水的空白对照。37 ℃培养24 h，观察抑菌圈现象，并测量抑菌圈直径（cm），记录结果并拍照。

1.3.5 抑菌活性测定

抑菌活性分别用抑菌圈直径和抑菌率表示，抑菌圈直径由十字交叉法[14]测定，取数据平均值，抑菌率按照如下公式计算[15]：

1.3.6 单因素试验

（1）浸提液质量浓度对抑菌效果的影响[16]：精确称取干燥伤力草茎组织粉末6份，净质量分别为5 g、10 g、15 g、20 g、25 g、30 g，分别使用体积为50 mL、100 mL、150 mL、200 mL、250 mL、300 mL蒸馏水浸泡，于25 ℃恒温水浴锅中浸提24 h，试验中直接浓缩至1.0 g/mL、2.0 g/mL、3.0 g/mL、4.0 g/mL、5.0 g/mL、6.0 g/mL。

（2）浸提温度对抑菌效果的影响[17]：精确称取干燥伤力草茎组织粉末6份，分别用200 mL蒸馏水浸泡，温度分别为25 ℃、37 ℃、50 ℃、65 ℃、80 ℃、95 ℃的水浴锅中加热24 h，将提取液过滤，保留上层清液，将上层清液置于离心机中4 ℃、4 000 r/min离心15 min，保留上层清液，置于旋转蒸发仪65 ℃浓缩至一定浓度后，置于4 ℃冰箱冷藏室中保存备用。

（3）浸提时间对抑菌效果的影响：精确称取干燥伤力草茎组织粉末6份，分别用200 mL蒸馏水浸泡，于25 ℃恒温水浴锅中分别浸提6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h，将提取液过滤，保留上层清液，将上层清液置于离心机中4 ℃、4 000 r/min离心15 min，保留上层清液，置于旋转蒸发仪65 ℃浓缩至一定浓度后，置于4 ℃冰箱冷藏室中保存备用。

1.3.7 响应面分析

以单因素试验为基础，选择蒸馏水为浸提溶剂，选择浸提液质量浓度（A）、浸提温度（B）和浸提时间（C）3个因素，每个因素3个水平，响应面法[18-20]优化伤力草茎水提液提取条件，响应面试验因素与水平如表1所示。

表1 伤力草茎部水提液抑菌成分提取工艺优化响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for extract process optimization of antibacterial components of water extract form Shangli grass stem

1.3.8 数据处理

试验数据用Excel 2016、SPSS 26.0、Design Expert 10.0.7软件进行统计分析，结果用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 不同组织水浸提液对大肠杆菌抑制效果

由图1可知，以无菌水浸泡的滤纸片为对照，经初筛发现只有伤力草茎部的浸提液对大肠杆菌具有一定抑制作用。复筛发现伤力草茎部水提液滤纸片四周出现明显的抑菌圈，进一步研究伤力草茎部水提液对大肠杆菌的抑制作用。

图1 不同组织水浸提液对大肠杆菌抑制效果的影响Fig. 1 Effect of different tissue extracts on bacteriostasis of Escherichia coli

2.2 不同条件对伤力草茎部浸提液抑菌效果的影响

2.2.1 不同浸提液质量浓度对伤力草茎部浸提液抑菌率的影响

伤力草茎部的不同浸提液质量浓度对大肠杆菌的抑制作用影响见图2。由图2可知，抑菌率随浸提液质量浓度的增大呈现上升的趋势。当浸提液质量浓度为1.0 g/mL时，伤力草茎部提取液的抑菌率最小，当浸提液质量浓度为5.0 g/mL时，对大肠杆菌的抑制作用最明显。根据试验结果，选择浸提液质量浓度为4.0 g/mL、5.0 g/mL、6.0 g/mL作为响应面试验水平。

图2 不同质量浓度对伤力草茎部浸提液抑菌率的影响Fig. 2 Effect of different extracts mass concentration from Shangli grass stem on bacteriostasis

2.2.2 不同浸提温度对伤力草茎部浸提液抑菌率的影响

不同浸提温度对伤力草茎部浸提液抑菌效果的影响见图3。由图3可知，抑菌率随浸提温度升高呈现先升高后降低的变化趋势，浸提温度为37 ℃时，伤力草茎提取液抑菌率达到最大值；继续升高浸提温度到50 ℃时，伤力草茎提取液抑菌率开始下降；浸提温度达到80 ℃以上时，则没有抑制作用。根据试验结果，选择浸提温度为25 ℃、37 ℃、50 ℃作为响应面试验水平。

图3 不同浸提温度对伤力草茎部浸提液抑菌率的影响Fig. 3 Effect of different temperature of extracts from Shangli grass stem on bacteriostasis

2.2.3 不同浸提时间对伤力草茎部浸提液抑菌率的影响

不同浸提时间的浸提液对伤力茎部的影响见图4。由图4可知，只有浸提时间超过18 h浸提液才有一定的抑菌现象出现，浸提时间为24 h时，伤力草茎部提取液抑菌率达到峰值，继续浸提到30 h时，抑菌率相对于24 h降低了19.8%，可能是浸提时间延长，破坏了抑菌活性物质；但继续延长浸提时间到36 h，抑菌率又出现了上升，这可能是随时间的延长，又浸提出了其他的具有抑菌作用的成分。根据试验结果，选择浸提时间为18 h、24 h、30 h作为响应面试验水平。

图4 不同浸提时间对伤力草茎部浸提液抑菌率的影响Fig. 4 Effect of different extraction time of extracts from Shangli grass stem on bacteriostasis

2.3 响应面法优化伤力草茎水浸提液提取条件

2.3.1 响应面试验结果

在单因素试验结果基础上，以伤力草茎部水浸提液的抑菌率为响应值，以浸提液质量浓度（A）、浸提温度（B）、浸提时间（C）为自变量，利用响应面法进一步优化伤力草茎部水浸提液的提取工艺[21]，所得的试验方案及结果见表2。

表2 伤力草茎部水浸提液抑菌成分提取工艺优化响应面试验结果与分析Table 2 Results and analysis of response surface experiments for extract process optimization of antibacterial components of water extracts from Shangli grass stem

利用Design-Expert 10.0.7软件将表2数据进行多元回归拟合，得出伤力草茎部浸提液对大肠杆菌抑制作用的二次多项回归方程：Y=87.392+0.175A+0.126B+1.152C-0.022AB+0.125AC-0.007BC-0.911A2-2.078B2-5.273C2。

2.3.2 方差分析

对模型进行方差分析[22]，结果如表3所示。结果表明，该模型P＜0.000 1，表示该模型极显著（P＜0.01）。失拟项=0.175 9＞0.05，模型失拟项不显著（P＞0.05）[23]，说明所得方程回归模型拟合真实水平，所选模型合适，可以使用该回归方程代替试验真实点分析试验结果[24]，本次试验的试验数据有意义。相关系数R2=97.44%，说明有97.44%的数据都可用该方程进行解释，具有较高的相关性，模型试验误差合理[25]。校正相关系数R2Adj=94.15%，该模型适应响应值变化94.15%。变异系数（coefficient of variation，CV）值[26]为0.92%，说明提取优化方法的结果准确可靠。由P值可知，模型的一次项中浸提时间对抑菌率影响高度显著（P＜0.01），交互项对抑菌率影响均不显著（P＞0.05），二次项中浸提液质量浓度对抑菌率影响显著（0.01＜P＜0.05），浸提温度和浸提时间对抑菌率影响极显著（P＜0.001）。

表3 响应面试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of regression equations for response surface experiments results

根据回归模型做出各因素交互作用对结果影响的响应曲面及等高线，结果见图5。

图5 浸提液质量浓度、浸提温度、浸提时间交互作用对伤力草茎部提取液抑菌率影响的响应曲面及等高线图Fig. 5 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between extract concentration,extract temperature and extract time on inhibition rate of water extracts from Shangli grass

响应面图坡度越陡表示响应值受该因素的影响越大[27]。由图5a可知，伤力草茎水提取液抑菌率随着浸提液质量浓度和浸提温度增加，均呈先上升后下降趋势，但是浸提液质量浓度的曲面坡度较缓慢于浸提温度的曲面坡度。由图5b可知，随着浸提液质量浓度的提高，伤力草茎部提取液抑菌率表现出先上升后下降趋势，但趋势较缓慢。而伤力草茎部水提取液抑菌率随浸提时间增加呈现明显先上升后下降趋势。可知，浸提时间对伤力草茎部水提液抑菌率的影响大于浸提液质量浓度对抑菌率的影响。由图5c可知，浸提时间的曲面坡度明显比浸提温度的曲面坡度陡峭，则浸提时间对伤力草茎部水提液抑菌率的影响大于浸提温度对其抑菌率的影响。综上所述，影响伤力草茎部水提取液抑菌率的因素顺序为浸提时间＞浸提温度＞浸提液质量浓度。

2.3.3 响应面优化结果验证

根据响应面拟合方程与模型预测可得出伤力草茎部水提取液抑菌率最高时的最佳提取工艺为：浸提液质量浓度5.104 g/mL，浸提温度37.876 ℃，浸提时间为24.663 h，预测抑菌率为87.467%，根据实际条件将最佳提取条件优化为浸提液质量浓度5.0 g/mL，浸提温度37 ℃，浸提时间为24 h，重复试验3次得到力草茎部水提取液抑菌率实际值为87.89%，模型预测值与实际测定结果相对误差为0.42%，说明响应面模型最终优化结果可靠。

3 结论

本试验采用伤力草叶部、茎部、根部的水提液抑制大肠杆菌，结果表明，叶部和根部的水提物不能抑制大肠杆菌的生长，只有茎部水提液对大肠杆菌抑制效果明显。本试验得出的伤力草茎部水提液对大肠杆菌抑制效果最佳的提取工艺为37 ℃水浴24 h，浓缩浸提液质量浓度为5.0 g/mL。此优化条件下，抑菌率是87.89%。