吴佳欣，樊芳蕾，赵若晴，王报贵

(滨州学院 生物与环境工程学院，山东 滨州 256600)

1 引言

柠檬(Citruslimon(L.) Burm. f.)，芸香科柑橘属植物，又称柠果、洋柠檬等。果皮厚，通常粗糙，其性喜温暖，耐阴，不耐寒，也怕热。柠檬原产东南亚，美洲也有分布，在我国, 柠檬的主要种植区域为长江以南，四川、福建、台湾省等地都有栽培,而以四川省安岳县种植量最大[1]。柠檬果实汁多肉脆，有浓郁的芳香气，富含维生素、柠檬酸、柠檬精油、柠檬黄酮、微量元素等成分,具有极高的药用价值[2,3]。柠檬果皮富含芳香挥发成分，可以生津解暑，开胃醒脾，长期食用有益身体健康。柠檬用途广泛，在烹饪、航空、医药、香料、美容等领域均有涉及，产生大量的柠檬皮成为必然，需要将这些废弃物充分利用起来，这样既不造成资源的浪费，同时也可以保护环境[4]。

黄酮是广泛存在于自然界的某些植物和浆果中的天然酚类物质，是一种具有强氧化作用的生理活性物质，具有多方面的功效，可有效清除体内的氧自由基，阻止细胞的退化衰老，能够改善人体血液循环，也可降低胆固醇水平等，适量摄入对人体有一定益处[5,6]，因此加大对柠檬皮中黄酮类物质的提取具有很大的现实意义。现研究黄酮提取方法有热水提取法、有机溶剂提取法、微波提取法、超声波提取法、酶解提取法、超临界流体萃取法、连续逆流提取法等[7～9]。超声波在液体中具有空化作用加速植物有效成分的浸出提取，因此超声波提取法提取黄酮类物质被广泛应用，是目前比较新的、提取得率相对较高的一种方法，具有设备简单、操作方便、提取时间短、溶剂用量少、产率高等优点[10,11]。

柠檬的皮、果肉、种子中含有丰富的黄酮类化合物，通常皮中含量较多，故黄酮类化合物广泛存在于柠檬皮中[12]，从柠檬皮中提取到的黄酮化合物可应用到多个领域，具有很大的经济价值。本试验旨在研究用超声波辅助乙醇提取的工艺提取柠檬皮中的黄酮类物质，通过改变乙醇浓度、超声时间、超声温度、超声功率和液固比5个因素[13,14]，对最终黄酮得率进行比较，选出适合且高效的最佳提取方式，进而为柠檬皮中黄酮的提取提供一种切实可行的工艺，同时也可以作为其他天然物质中黄酮提取的实验依据。

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

柠檬(四川柠盟)；无水乙醇(烟台远东精细化工有限公司)；芦丁标品(合肥博美生物科技有限责任公司)；硝酸铝(天津市福晨化学试剂厂)；亚硝酸钠(天津市福晨化学试剂厂)；氢氧化钠(天津市福晨化学试剂厂)。

2.2 仪器与设备

托盘，离心管(50 mL)，40目筛，移液枪(1000 μL)，烧杯(250 mL)，量筒(100 mL，50 mL)，容量瓶，剪刀，胶头滴管，试管(25 mL)，移液管(5 mL，10 mL)。

组织捣碎机(上海左乐仪器有限公司)；电子天平(上海菁海仪器有限公司)；红外干燥箱(上海景迈仪器设备有限公司)；冰箱(山东海信公司)；超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技中国有限公司)。

2.3 实验方法

2.3.1 样品预处理

将新鲜柠檬洗净去皮，用剪刀将柠檬皮剪成小条状，平铺在洁净且干燥的托盘上，温度维持在45 ℃于红外干燥箱中烘干直至恒重，然后取出用组织捣碎机进行粉碎处理，之后过40目筛，将筛出粉末装入密封袋放入冰箱冷冻室中保存备用。

2.3.2 绘制芦丁标准曲线

用电子天平准确称取20.00 mg芦丁标准样品，于45 ℃恒温水浴下使用无水乙醇溶解，在室温下定容于烧杯(50 mL)中、震荡摇匀，备用。准备6个25 mL具塞试管，将芦丁标准母液用移液管(5 mL)分别吸取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL至25 mL具塞试管中，同时做空白试验。首先向各试管加入1.5 mL 5%的亚硝酸钠溶液，震荡摇匀，静置6 min，之后加入等量10%的硝酸铝溶液，重复上述操作，最后加入7.5 mL 4%的氢氧化钠溶液，再用相同浓度的乙醇定容至25 mL，震荡摇匀，静置15 min[15]。以空白对照组为参照，在紫外分光光度计的510 nm处测定各试管样品的吸光值，每组样品做3个平行试验，结果取平均值，以各组样品计算得到的芦丁标准母液浓度为横坐标(x)，OD值为纵坐标(y)绘制芦丁标准曲线。

2.3.3 黄酮提取

准确称取1.000 g柠檬皮粉末于50 mL离心管中，向其中加入不同浓度或体积的乙醇浸取液，震荡摇匀，在不同的超声功率或超声温度下提取相应时间的黄酮。之后再放入高速冷冻离心机，于4200 r/min离心20 min后取上清液，静置备用。

2.3.4 黄酮含量测定

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH光度法检测样品总黄酮含量[16]。用移液枪(1000 L)分别吸取2 mL备用样品液于50 mL离心管中，并依次添加NaNO2溶液、Al(NO3)3溶液和NaOH溶液各0.8 mL，静置时间分别为6 min、6 min和15 min，每次添加后均需将混合液摇匀。最后于510 nm处测定其OD值，依照上步绘制的芦丁标准曲线得出各样品的对应浓度，按照公式(1)计算出总黄酮总量：

(1)

式(1)中：c为由芦丁标准曲线得出待测样液中对应的总黄酮浓度，mg/mL；n为稀释倍数；v样液的总体积，mL；m为柠檬皮粉末质量，mg；w为总黄酮含量。

2.3.5 单因素试验

准确称取柠檬皮粉末1.000 g，按照不同的乙醇浓度与液固比分别添加乙醇浸取液(均呈等差递增)，在不同的超声功率和超声温度下浸取不同的时间，在高速冷冻离心机中于4200 r/min离心20 min，之后吸取上清液测其510 nm处的OD值，利用芦丁标曲得出对应浓度，进而求得总黄酮提取率。单因素各水平详见表1。

2.3.6 正交试验

单因素试验后，对各因素的吸光值进行比较分析，选出其中4个影响较大的因素进行后续正交试验，通过对总黄酮得率的分析得出最优的提取工艺。正交因素各水平详见表2。

表1 单因素试验水平选择

表2 正交试验因素水平

2.3.7 数据处理

绘制芦丁标准曲线，查阅相关资料确定单因素试验条件选取范围，记录单因素实验数据，制定单因素水平表，利用Excel绘制标曲并用Prism软件绘制折线图观察趋势；依据单因素试验结果确定正交试验因素并制定因素水平表、正交表；通过对正交表的分析进而得到总黄酮得率最高的黄酮提取最佳组合，由此确定最佳的黄酮提取工艺。

3 结果与分析

3.1 芦丁标准曲线的绘制

由图1可以得出，芦丁标准曲线回归方程为y=11.486x+0.0003，R2=0.9997，线性关系较好，可用于下面实验。

图1 芦丁标准曲线

3.2 单因素试验结果

3.2.1 超声温度对总黄酮得率的影响

在相同前提下改变超声提取的温度，得到不同超声温度与总黄酮得率的关系如图2所示。在20～40 ℃时黄酮提取率与提取时的温度成正比，超声温度越高，总黄酮得率越大。这种情况的出现可能是因为随着温度的升高，柠檬皮粉末中的分子运动速度加快，使得黄酮更易于从细胞中向溶液中转移。在超声温度达到40 ℃时总黄酮提取率为0.652%，温度高于40 ℃则随着超声温度的升高黄酮得率迅速降低，这可能是由于温度过高加快了乙醇的挥发程度，同时破坏了柠檬皮粉末中的部分黄酮类物质，导致提取率降低。综合考虑后确定40 ℃为最佳的提取温度，并以此作为后续试验的固定条件之一。

图2 超声温度对总黄酮得率的影响

3.2.2 乙醇浓度对总黄酮得率的影响

在相同前提下改变乙醇体积浓度，得到不同乙醇浓度与总黄酮得率的关系如图3所示。通过图3得知：在40%乙醇浓度时黄酮提取率为0.622%，在乙醇浓度为40%～70%时随着浓度的升高总黄酮得率呈增大的趋势，这可能是由于黄酮类物质在乙醇浓度过低时难以浸出完全，当乙醇浓度为70%时提取率达到了0.763%，原因可能是柠檬皮中黄酮类物质的极性与浓度为70%的乙醇溶液极性相似，当乙醇浓度超过70%时黄酮得率出现下降的趋势，超过80%则降低幅度增大，可能是随着乙醇浓度的升高，柠檬皮粉末中溶出的脂溶性物质增多从而影响了黄酮的相对浸出量，且乙醇浓度过高导致溶液中渗透压过大，降低了黄酮的提取率。因此可以确定:提取黄酮最佳的乙醇浓度为70%，并以此作为后续试验的固定条件之一。

图3 乙醇浓度对总黄酮得率的影响

3.2.3 液固比对总黄酮得率的影响

在相同前提下改变乙醇的用量，得到不同液固比与总黄酮得率的关系如图4所示。通过图4可以了解到，从整体上看，当液固比为15∶1时黄酮提取率最低为1.226%，液固比为30∶1时总黄酮得率达到1.318%，液固比大于30∶1时总黄酮得率开始降低。这是因为溶剂过少时黄酮无法充分浸出，随着溶剂倍数的增大使得溶剂与柠檬皮粉末的接触面积增多，促进了黄酮化合物的提取，而溶剂过多时由于杂质的浸出量增多以及溶液的稀释效应而导致提取率下降。在固液比为20∶1时出现了一个小高峰，之后出现短暂下降又升高的现象，难以得出液固比显著的最佳条件，因此将固液比舍去，不进行后续实验。

3.2.4 超声功率对总黄酮得率的影响

在相同前提下改变超声提取的功率，得到不同超声功率与总黄酮得率的关系如图5所示。通过图5可以了解到，超声功率在500 W时黄酮得率达到1.175%，低于500 W时黄酮得率随超声功率的升高而增加，这是因为超声功率产生的空化效应得到了增强，加快了黄酮从细胞中向溶液中渗透的速度，所以得率逐渐增大，在500～700 W的超声功率范围内黄酮得率逐渐降低，在700 W时为1.127%，可能是由于较大的超声功率破坏了黄酮化合物的稳定性从而使提取量降低，而当超声功率大于700 W时，黄酮总得率又随着超声功率的增大而增加，这种情况的出现可能是由于超声功率过大使得提取温度明显升高，导致黄酮提取率随之增加。综合考虑后确定500 W为最佳黄酮提取功率，并以此作为后续试验的固定条件之一。

图4 液固比对总黄酮得率的影响

图5 超声功率对总黄酮得率的影响

3.2.5 超声时间对总黄酮得率的影响

在相同前提下改变超声提取的时间，得到不同超声时间与总黄酮得率的关系如图6所示。通过图6可以了解到，超声时间为10 min时黄酮提取率为1.034%，在超声时间为10～50 min范围内总黄酮得率随着超声时间的延长而增加，在50 min提取率达到1.178%，这可能是由于在黄酮提取初期随着超声时间的增加，柠檬皮粉末受到的气蚀作用促使细胞破裂彻底，进而使得更多的黄酮化合物溶于乙醇溶剂中，从而提高了黄酮得率，当超声提取时间超过50 min后，总黄酮得率开始降低，原因可能是超声时间过长使得更多的杂质浸出细胞而影响了黄酮的浸出量，且时间过长会破坏细胞中黄酮物质的活性也会使黄酮得率降低。因此可以确定黄酮提取的最佳超声时间为50 min，并以此作为后续试验的固定条件之一。

图6 超声时间对总黄酮得率的影响

3.3 正交试验结果

通过对单因素试验的数据分析，选取对柠檬皮中黄酮提取影响较显著的4个因素进行后续正交试验，分别为超声温度、乙醇浓度、超声功率和超声时间，以此来优化黄酮提取工艺，得出最优提取条件。由于液固比对黄酮提取率的影响趋势不明确，综合考虑后选择总黄酮得率最高的30∶1为固定液固比，得到正交试验结果见表3。

正交试验数据结果表明，提取柠檬皮粉末中黄酮的最优组合为A3B3C3D1，总黄酮得率达到了1.300%。通过R值可以看出，超声功率对黄酮提取的影响最为显著，其余依次为超声时间、乙醇浓度，超声温度的影响最弱，因此得出最佳的提取条件为超声温度45 ℃；乙醇浓度75%；超声功率600 W；超声时间45 min；液固比30∶1 (mL/g)。

4 结论和讨论

4.1 结论

本试验利用单因素试验和四因素三水平正交试验提取柠檬皮中的黄酮类物质，通过对试验结果的研究分析，最终确定了超声波辅助提取柠檬皮中总黄酮的最佳提取工艺为超声温度45 ℃；乙醇浓度75%；超声功率600 W；超声时间45 min；液固比30∶1 (mL/g)，此时总黄酮得率最高，为1.300%。该研究具有一定的实用意义，既证明了柠檬皮中具有丰富的黄酮化合物，也为之后天然产物中提取黄酮提供了参考价值。

表3 正交试验结果

4.2 讨论

研究表明，光照、温度、水分、营养等环境因素会影响植物中黄酮类化合物的合成[17]，柠檬适宜于在冬无严寒、夏无酷热的地方种植，以土层深厚、含有机质丰富、保湿保肥力强的缓坡地为最佳，要求雨水分布均匀，气温平稳，光照充足[18]，这些可能是使得柠檬中黄酮含量较多的原因。柠檬皮粉末应储存在冰箱中以保持低温干燥的状态，确保黄酮的损失降低到最小程度，由于柠檬中总黄酮含量会随着储存时间的延长而降低[19]，所以备用的柠檬皮粉末不宜放置过长时间，应尽快进行试验。

由于实验条件的关系，本文未对柠檬皮中黄酮类物质进行进一步的分析与研究，之后有机会将深入研究黄酮类物质的生理特性与理化性质，以挖掘黄酮化合物更多的使用价值。