杨金玲

(临沂市中医医院，山东 临沂 276002)

杞蓉胶囊由杞蓉片改剂型而来，由枸杞子、肉苁蓉、锁阳、蛇床子、女贞子、五味子、金樱子、淫羊藿、菟丝子九味药组成，有补肾固精，益智安神的功效，用于肾亏遗精、阳萎早泄、失眠健忘等症状。杞蓉片原质量标准为部颁标准[1]，仅包括性状项、理化鉴别项、淫羊藿的薄层鉴别和检查项，未收载含量测定项，不能很好地控制产品质量。毛蕊花糖苷在临床上对治疗帕金森病有效，其机制可能与黑质纹状体系统中酪氨酸羟化酶的表达、改善海马突触可塑性、促进海马神经生长因子及减轻氧化应激有关[2-3]。本研究建立了杞蓉胶囊中源自药材肉苁蓉成分-毛蕊花糖苷的含量测定方法，该法简单、灵敏度高、分离度好。

1 仪器与试药

1.1仪器 高效液相色谱仪(美国waters公司)；Kromasil C18柱(4.6×250 mm，5 μm)；Agilent 8453紫外可见分光光度计(安捷伦公司)；SB-4200 DTD型超声波清洗机(宁波新芝生物科技有限公司)。

1.2试药 杞蓉胶囊(自制，规格：0.32 g/粒；批号：20150401、20150402、20150403)；毛蕊花糖苷对照品购自中国食品药品检定院，批号：111530-201411(供含量测定用)，乙腈、甲醇为色谱纯，水为蒸馏水，其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱Kromasil C18柱(4.6×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈-甲醇-1%醋酸溶液(12∶13∶75)；流速1.0 mL/min；柱温：室温。检测波长334 nm；进样量20 μL。理论板数按毛蕊花糖苷峰计算不得低于3000。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液制备 精密称取毛蕊花糖苷对照品适量，加流动相制成含毛蕊花糖苷0.0812 mg/mL的对照品储备液。再精密量取对照品储备液适量，加流动相制成含毛蕊花糖苷0.0203 mg/mL的对照品溶液。

2.2.2供试品溶液 取杞蓉胶囊内容物约2.5 g，精密称定，移入锥形瓶中(具塞)，精密加入1%醋酸50%甲醇溶液25 mL，密塞，称定重量，超声处理40 min，放冷，再称定重量，用上述同样溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3阴性对照溶液 按杞蓉胶囊处方比例称取缺肉苁蓉的其他药味，按照杞蓉胶囊制备工艺制备阴性样品，并按2.2.2项下方法操作，制备阴性对照溶液。

2.3专属性试验 取上述对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各20 μL，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图，结果：供试品中毛蕊花糖苷与对照品色谱峰保留时间一致，与相邻峰分离度大于1.5，阴性对照溶液未见该峰，表明杞蓉胶囊中其他成分对毛蕊花糖苷的测定无干扰。结果见图1。

A毛蕊花糖苷对照品溶液 B供试品溶液 C阴性对照溶液；a毛蕊花糖苷图1 毛蕊花糖苷HPLC图

2.4线性关系考察 分别精密量取毛蕊花糖苷浓度为0.0812 mg/mL对照品储备液1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL，置于10 mL量瓶中，加入流动相稀释至刻度，摇匀，即得系列毛蕊花糖苷对照品溶液。取上述系列对照品溶液各取20 μL依次注入高效液相色谱仪，记录色谱峰。以峰面积(Y)为纵坐标，进样量(X，μg)横坐标，绘制标准曲线，得毛蕊花糖苷回归方程为：Y=4.58+1608.23X，相关系数r=0.9994，n=6。

结果表明，毛蕊花糖苷进样量在0.2436-0.6496 μg范围内有良好的线性关系。

2.5精密度试验 吸取2.2.1项下对照品溶液20 μL，连续进样6次，测定其峰面积，结果RSD为0.35%，表明仪器精密度良好。

2.6重复性试验 精密称取6份杞蓉胶囊内容物粉末，各2.5 g，按2.2.2项下方法，分别制备供试品溶液，进样20 μL，记录其峰面积，计算含量，结果RSD为1.12%，表明方法重复性较好。

2.7稳定性试验 取同一供试品溶液分别于0、2、4、8、12、24 h，按2.1项下色谱条件分别进样1次，每次20 μL，记录其峰面积，以峰面积计算，结果RSD为0.94%，表明杞蓉胶囊供试品溶液24 h内稳定。

2.8加样回收率试验 取毛蕊花糖苷含量为0.1675 mg/g的杞蓉胶囊(批号：20150401)6份，分别精密称定，精密加入毛蕊花糖苷对照品0.2110 mg，按2.2.2项下方法制备制成6份供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，计算回收率。结果见表1。结果表明本法具有良好的加样回收率。

表1 杞蓉胶囊加样回收率试验结果(n=6)

2.9样品含量测定 取3批样品(批号：20150401、20150402、20150403)，制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，用外标法计算含量，结果见表2。

表2 杞蓉胶囊中毛蕊花糖苷的含量

3 讨论

3.1流动相选择 有研究曾用乙腈-甲醇-1%醋酸溶液(8∶13∶79)、乙腈-甲醇-1%醋酸溶液(10∶15∶75)、乙腈-1%冰醋酸溶液(20∶80)等作为流动相[4-6]。经试验，以本文所用流动相分离效果较好。

3.2提取溶剂选择 分别采用1%醋酸甲醇溶液、1%醋酸50%甲醇、流动相进行提取，结果表明，以1%醋酸甲醇溶液提取的样品毛蕊花糖苷峰峰形前延，而用1%醋酸50%甲醇和流动相提取的样品峰形较好，提取率高，且无明显差异，但用流动相提取时滤过较困难，故选择1%醋酸50%甲醇为含量测定用提取溶剂。

3.3不同提取方式考察 以1%醋酸50%甲醇为提取溶剂分别采用超声波和加热回流两种提取方式，结果表明：超声波提取与加热回流提取无明显差异，为简化试验操作，故选择提取方式为超声提取40 min。

3.4提取时间考察 分别超声提取20、40、60 min测定样品含量，结果表明：超声提取40 min与60 min比较几乎无明显差异，为节约时间，提高效率，故选择超声提取40 min较好。