蒲艳芬 赵太均 许家倚 粟小娓 卢智琴 李云婷 陈玉皎，，3* 曹 军*

（1贵州贵安精准医学股份有限公司，贵州贵安 561113；2贵州航天智慧农业有限公司，贵州贵阳 550081；3重庆大学生物工程学院生物流变科学与技术教育部重点实验室/重庆市血管植入物工程实验室，重庆 400044）

蛹虫草是一种传统中药，现代医学证明，蛹虫草具有较高的药用价值，其抗肿瘤作用在医疗及保健领域备受瞩目[1]，并且被证明比冬虫夏草具有更高的虫草素和虫草酸含量[2]。蛹虫草活性成分包括麦角甾醇、虫草酸、核苷和多糖[3−4]。据报道，不同类型的蛹虫草提取物具有多种药理活性，如免疫调节、抗肿瘤、抗炎和抗氧化活性等[5−7]。

癌症是一种较为普遍的疾病，有较高的发病率和死亡率，对人类健康危害较大，现阶段治疗癌症的主要方法有手术、化疗和放疗，但这些方法都存在各种局限性[8]。因此，寻找具有高效安全性的天然抗癌新药，是预防或治疗癌症迫切需要。近年来，麦角甾醇和虫草素抗癌作用的研究得到很好的发展。如真姬菇中分离出的麦角甾醇对小鼠皮肤癌有较好的治疗作用[9]。此外，有研究筛选13个对11种细胞系有抗癌活性的药用菌，发现皱盖假芝提取物对癌症的抑制效果最好。对皱盖假芝提取物分离纯化，发现其中的麦角甾醇能诱导乳腺癌细胞凋亡[10]。麦角甾醇与顺铂两药联用能显著抑制A549细胞增殖和迁移能力，阻滞细胞G2/M期分裂，诱导并激活PARP−1依赖的细胞凋亡[11]。LIN等[12]发现，麦角甾醇与两性霉素B联用，能够有效地诱导人肝癌细胞坏死。麦角甾醇还可通过增高p21 m RNA和蛋白表达来抑制Hep G2细胞增殖等[13]。越来越多的研究表明虫草素作为虫草的一种生物活性化合物，在体外具有抗肿瘤作用[14−16]。虫草素可以阻断mTOR（雷帕霉素的哺乳动物靶标）信号通路[17]，其通过调节AMPK/mTORC1信号通路，从而下调GBC−SD胆囊癌细胞中对HIF−1α的多种耐药性[18]。

这一系列的研究表明，麦角甾醇和虫草素的抗肿瘤作用明显，且作用机制有所不同。笔者研究团队前期通过以家蚕蛹虫草（海宁株）子实体为原料，采用工业色谱技术提取分离获得的新构像麦角甾醇，并研究证明该麦角甾醇不是通过提高免疫力发挥抗肺癌和肝癌作用[19−20]。

基于以上，笔者创新性地联合采用家蚕蛹虫草（海宁株）子实体中获得的新构像麦角甾醇和虫草素联用，初步考察其急性毒性，并进一步构建H22和Lewis荷瘤小鼠模型，研究其抗肺癌和肝癌的药效，希望能够为肺癌和肝癌的药物开发提供良好的试验及应用基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

注射器（上海治宇医疗器械有限公司）；EL电子天平（常州天之平仪器设备有限公司）；超净工作台[力康精密科技（上海）有限公司]；组织匀浆器（济南天方机械有限公司）。

Lewis肺癌瘤株（第5代）；H22肝癌瘤株（第3代）；C57 BL/6小鼠（18~22 g）（动物许可证号：SCXK（京）2 012~0001，合格证号：11400700020779）、KM小鼠（18~22 g）（动物许可证号：SCXK（京）2 012~0001，合格证号：11400700020779）[中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，SCXK（军）2 012~0004）]；饲料（中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，SCXK（军）2 007~001）]；麦角甾醇、虫草素（贵州贵安精准医学股份有限公司采用自主培养的家蚕蛹虫草（海宁株）子实体提取分离获得，HPLC检测纯度分别为99.96%和99.98%）；环磷酰胺片（天津金世制药有限公司，20130101）；吐温80（北京博润莱特科技有限公司分装）。小鼠饲养环境：普通级，室温，常规饲喂。

1.2 药物制备方法

麦角甾醇和虫草素灌胃剂（混合药物）：按3∶2称取一定量的麦角甾醇和虫草素样品至研钵中，加入所需溶剂体积2%吐温−80，充分研磨后再加入所需体积的生理盐水，混匀后备用。

环磷酰胺灌胃剂：去掉环磷酰胺片的薄膜衣后，称取一定量至研钵中，加入所需体积的生理盐水，充分研磨、混匀后备用。

1.3 急性毒性试验

将50只试验小鼠共分为5组，每组10只，雌雄各半，分为①混合物高剂量组（11 g/kg）、②混合物中剂量组（5 g/kg）、③混合物中低剂量组（4 g/kg）、④混合物低剂量组（3 g/kg）、⑤空白组（2%吐温80生理盐水），以上各组小鼠空腹12 h后，按各组别给药剂量灌胃给药一次。观察指标：每日对各组小鼠进行称重、饮食量计算、是否有死亡及是否有中毒反应的发生，并记录，于第14天对各组小鼠进行解剖观测。

1.4 抑制肺癌和肝癌肿瘤生长药效试验

1.4.1 小鼠Lewis肺癌和H22肝癌荷瘤模型建立

取接种肿瘤8~13 d状态良好的荷瘤小鼠脱臼处死，体表酒精消毒，在无菌（超净台）环境下剥离小鼠肿瘤至盛有生理盐水的无菌平皿，剪至小块，将小块肿瘤放入组织匀浆器，按体积比1∶3加入生理盐水匀浆，匀浆液倒入50 mL无菌离心管，备用。用1 mL注射器在C57（Lewis）和KM（H22）小鼠右腋下注射接种0.2 mL，肿瘤细胞混悬液的制备均在无菌条件下（超净工作台中）完成。从取出肿瘤腹水至肿瘤接种完毕在60 min内完成。

1.4.2 分组及给药方法

将60只试验小鼠共分为6组，每组10只，雌雄各半，分为①混合物低剂量（67 mg/kg）组、②混合物中剂量（200 mg/kg）组、③混合物高剂量（600 mg/kg）组、④环磷酰胺组、⑤模型组、⑥空白组，以上除空白组外，其余各组在注射肿瘤混悬液后，均每日给药一次，每次每只0.2 mL，连续给药10 d，空白组在相同给药时间及给药时长灌胃给予2%吐温−80水溶液，连续灌胃10 d。

1.4.3 肺和肝组织、瘤重和肿瘤抑制率的计算

每日观察小鼠右腋下，于最后一次给药24 h后，解剖并取出肺、肝称重，解剖并取出肿瘤组织，称重，并计算肿瘤生长抑制率。

1.5 数据统计

采用SPSS软件进行统计分析，各组别采用one−way ANOVA检验。

2 结果与分析

2.1 急性毒性试验

由表1可以初步推测，混合药物给药剂量为3~11 g/kg时，采用灌胃给药方式，对小鼠的体重及饮食无影响（图1）。

图1 不同给药剂量小鼠体重及饮食量变化

表1 混合药物急性毒性试验结果

高剂量（11 g/kg）给药量小鼠全部死亡，均在给药后6 h内死亡；中剂量（5 g/kg）给药小鼠存活率为20%，1只为给药13 d后死亡外，其余均在给药后6 h内死亡；中低剂量（4 g/kg）给药小鼠存活率为30%，除2只为给药2 d后死亡外，其余均在给药后6 h内死亡。对死亡小鼠的外观及大体解剖可见图2，各组别、各死亡时间小鼠均可见其胃部较为膨大且胃壁较薄，高剂量及中剂量组别小鼠外观可见其四肢、口部暴露的皮肤呈现明显红色。由此推断，其死亡原因可能由于所灌服药剂对胃部产生较大的刺激性而使胃部出现较多的胀气，引起胸部隔膜上升，胸腔空间缩小，导致呼吸困难而死亡。

图2 解剖死亡的小鼠

在中毒反应方面，给药剂量为3~5 g/kg的小鼠均出现不同程度的中毒反应，包括竖毛、困倦，涉及自主神经系统及睡眠中枢系统。解剖给药后14 d仍存活的小鼠，观测其主要脏器，并未发现有明显变化。

根据试验数据，应用Bliss方法计算联合给药的LD50，其结果为LD50=3.98 g/kg。

2.2 联合给药的抗肺癌肿瘤作用

由表2、图3结果可知，联合给药剂量为600 mg/kg，服药10 d组与Lewis肺癌肿瘤模型小鼠比较有极显著差异（P＜0.01），此剂量与环磷酰胺组比较无明显差异，但肿瘤抑制率优于环磷酰胺。除环磷酰胺组与模型组未出现肺癌转移外，其余各组均出现10%~20%的肺癌转移现象，但无统计学意义。

图3 抗肺癌试验结果

表2 抗小鼠肺癌试验结果（±s）

表2 抗小鼠肺癌试验结果（±s）

注：与模型组比较**P＜0.01，*P＜0.05。

组别高剂量组中剂量组低剂量组环磷酰胺组模型组剂量/（mg·kg−1）600 200 67 20存活率/%100 100 100 100 100小鼠净体重变化/g−1.24±1.30−0.88±2.34 0.34±1.19−1.68±1.46*0.04±1.86肺重/g 0.18±0.04 0.19±0.03 0.17±0.03 0.16±0.02 0.21±0.13瘤重/g 0.52±0.29**0.76±0.39 0.79±0.27 0.59±0.29**1.04±0.50肿瘤抑制率/%50.05 26.11 23.78 42.85

环磷酰胺组小鼠出现体重下降，且与模型组比较有显著差异（P＜0.05）；600 mg/kg剂量组出现体重下降，与67 mg/kg剂量组比较有显著差异（P＜0.05）；67 mg/kg剂量组体重上升，且与环磷酰胺组比较有极显著差异（P＜0.01）。

2.3 联合给药抗肝癌肿瘤作用

由表3、图4结果可知，联合给药剂量为600 mg/kg，服药10 d组与H22肝癌肿瘤模型小鼠比较有显著差异（P＜0.05），且在剂量为600 mg/kg时有较高的肝癌肿瘤抑制率（＞40%）；环磷酰胺组与模型组比较有极显著差异（P＜0.01），剂量为600 mg/kg时与环磷酰胺组比较，肿瘤抑制率无明显差异。

表3 抗小鼠肝癌试验结果（±s）

表3 抗小鼠肝癌试验结果（±s）

注：与模型组比较**P＜0.01，*P＜0.05。

组别高剂量组中剂量组低剂量组环磷酰胺组模型组剂量/（mg·kg−1）600 200 67 20存活率/%100 100 100 100 100净体重变化量/g 4.67±4.65**6.19±3.37 5.60±2.53 3.22±3.12**8.11±4.66肝重/g 1.54±0.26*1.57±0.39 1.63±0.44 1.34±0.29**1.86±0.39瘤重/g 0.57±0.20*0.76±0.29 0.94±0.40 0.49±0.21**1.06±0.30肿瘤抑制率/%45.98 28.55 11.14 54.03

肝重方面，在剂量为600 mg/kg时，与模型组比较有显著差异（P＜0.05），环磷酰胺组与模型组比较有极显著差异（P＜0.01）。

净体重变化方面，给药剂量为600 mg/kg时及环磷酰胺组与模型组比较均呈现极显著差异（P＜0.01）。各组别小鼠均未出现癌细胞肝转移现象。

图5 抗肝癌试验结果

3 小结

初步试验结果表明，在安全剂量范围内，家蚕蛹虫草（海宁株）子实体中麦角甾醇与虫草素联合给药具有抗小鼠肺癌肿瘤及肝癌肿瘤生长的作用，为肺癌和肝癌药物的开发及应用建立良好的试验基础。

未来还需进一步深入研究联合给药的抗肿瘤作用机制。此外，两种抗肿瘤活性物质联合使用，是否可以减少对正常细胞的毒性和延缓耐药性，从而达到更好的抗癌疗效，仍在进一步研究中。