杨振宇，王宝慧，宋诗娟，石志勇，牛景萍，梁建萍，2

（1.山西农业大学 生命科学学院，山西 太谷 030801；2.中兽医药现代化山西省重点实验室，山西 太谷 030801）

黄芪是豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根[1]，主要分布在山西、甘肃、陕西和黑龙江省等地。药理研究表明，黄酮、皂苷和多糖是黄芪的主要药效成分，具有抗炎、免疫刺激、抗氧化、抗衰老、保护心脏等作用[2]。随着人们健康保健意识的提高，特别是中医药在抗击非典、新冠疫情中发挥的独特作用，中药材生产迎来了难得的发展机遇。目前，市场所售商品黄芪主要通过人工种植进行生产。然而，黄芪在种植过程中缺乏科学施肥指导，盲目施用化肥以追求产量，导致氮肥流失[3]、土壤酸化、有机质含量下降、病虫害频发；同时，黄芪产量和品质也明显降低。因此，施用生物有机肥是实现土地用养结合，推进黄芪生态种植的必经之路[4]。

国内外利用豆科和禾本科植物固氮菌制作菌肥的研究较多。例如，李娜等[5]使用不同浓度的费氏中华根瘤菌、放射型根瘤菌以及田菁茎瘤固氮根瘤菌菌液分别浸染广金钱草种子，发现在1×107cfu/mL 浓度条件下，3 种菌液浸种均获得最大萌发指标，其中，田菁茎瘤固氮根瘤菌试验组效果最显著，发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数分别高于对照组16.00%、9.33%、9.51 和41.34%；放射型根瘤菌试验组和田菁茎瘤固氮根瘤菌试验组幼苗叶绿素含量较对照组分别增加1.47%和7.47%，含氮量分别增加0.57%和5.17%，3 种菌液均能在不同程度上提高广金钱草种子的发芽能力和植株生长期的叶绿素含量和含氮量。近年来，固氮菌剂的研究已由单一菌种向复合菌种方向发展[6]。伍惠等[7]从长势良好的大豆根系分离高效固氮菌费氏中华根瘤菌（Sinorhizobium fredii）HN01 与慢性型大豆根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）USDA110并制成固体和液体菌剂，施肥条件下，施固体菌剂使冀豆12、黑农61 和龙哈10-4139 产量分别提高11.33%、19.5%和7.1%；加施液体菌剂，冀豆12 和冀豆17 分别增产6.52%和8.27%。常规施肥减半（50%）条件下，配施根瘤菌固体菌剂使冀豆17 增产4.68%。在不施常规肥的条件下，施固体菌剂使龙哈10-4139 增产20.3%；施液体菌剂使冀豆17 增产0.93%。刘华伟等[8]将2 种固氮菌田菁茎瘤固氮根瘤菌（Azorhizobium caulinodans）ORS571 与 巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）Yu62 接种于渗透胁迫下小麦，结果表明，接种固氮菌能显著增加小麦幼苗脯氨酸与可溶性蛋白含量，提高小麦幼苗抗胁迫能力，且多固氮菌混合后效果均高于单一固氮菌。

目前，菌肥的研究已经从作物逐渐拓展到中药材上，针对中药材专用固氮菌肥的研究报道越来越多。例如，刘潇晗等[9]用田菁茎瘤固氮根瘤菌菌液浇灌萌发结束的穿心莲幼苗，结果表明，处理组的开花株数是对照组的3.5 倍；株高、分枝数、叶片数分别较对照组提高13.40%、16.75%、57.73%；地上部分鲜质量、干质量分别较对照组提高60.80%、67.08%；地下部分鲜质量、干质量分别较对照组提高24.40%、14.75%；同时还发现地上部分穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的总量较对照组提高16.16%。固氮菌剂的添加对土壤养分和酶活也有改善作用，如何国兴等[10]将6 株根瘤菌分别制成固体菌肥Da99、DL58、G3G2、Ga66、QL31B 和Wa32，在苜蓿大田中进行随机区组试验，结果表明，施加菌肥Wa32 处理后土壤有机质、碱解氮和速效磷含量分别较对照提高了75.39%、22.79%和76.63%；菌肥Da99 和G3G2 处理后速效钾含量较对照分别显著提高了27.35%和24.03%；各菌肥处理均能提高土壤脲酶活性，对土壤过氧化氢酶活性影响不显著；菌肥QL31B 处理后土壤蔗糖酶和碱性磷酸酶活性较对照分别提高了76.94%和21.81%；菌肥G3G2和Ga66 处理后土壤纤维素酶活性较对照分别提高了22.35%和18.82%。

虽然对中药材固氮菌剂的研究越来越多，但对中药黄芪固氮菌剂的研究还较少。黄芪作为一种豆科植物，可与根际微生物互作进行固氮，为充分挖掘这一特性，结合甘肃、山西两地土壤类型和气候特点，将前期实验室筛选到的5 株互不拮抗可混合使用的高效固氮菌株[11-12]复合使用，研制促进黄芪生长的固氮菌肥，对降低黄芪生产成本、减肥增效、降低环境污染有着重要的实际意义。

本研究为了明确固氮菌剂对黄芪植株与种植地土壤的影响，通过对比固氮菌剂拌种与蒸馏水拌种后1 年生与2 年生蒙古黄芪各项生长指标、药效成分积累及其种植地土壤养分水平和酶活性的变化，旨在为黄芪专用肥的研制与黄芪的科学种植提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验地概况

试验于2020 年7 月至2021 年10 月在山西省汾阳市山西农业大学经济作物研究所试验示范基地（东经111°47′42.13″，北纬37°14′55.90″）进行。该地处于黄土高原，属于温带季风气候，年平均气温10.7 ℃，年平均降水量419.8 mm，年日照时数2 389.5 h，无霜期202 d 左右。

1.2 试验材料

试验用黄芪种子为山西省浑源县新鲜蒙古黄芪种子，5 株黄芪高效固氮菌分离自黄芪道地产区甘肃省陇西县、山西省浑源县与山西省静乐县的黄芪根瘤与根际土壤中。经16S RNA 测序，试验所用5 株菌株中2 株为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，实验室编号J1 与G4；1 株为滋养节杆菌Arthrobacter pascens，实验室编号J2；1株为根瘤菌Rhizobiumsp.，实验室编号t16；1 株为中华根瘤菌Sinorhizobiumsp.，实验室编号t21。

1.3 试验设计

试验设施加菌剂（菌Ⅴ）和不施加菌剂（CK）2 个拌种处理。将5 种黄芪高效固氮菌分别用接种环取1～2 环接种于10 mL 灭菌后的酵母甘露醇液体培养基中，设置摇床28 ℃、180 r/min 培养48 h，菌液浓度大于1×1010cfu/mL，每种菌取5 mL放入盆中混合，用蒸馏水1∶100 稀释（活菌约为1×108cfu/mL）制成拌种菌液（简称菌Ⅴ），分别使用拌种菌液与蒸馏水对1 kg 黄芪种子拌种，静置30 min 后取出种子进行播种。每小区面积30.0 m2，重复3 次，行距30 cm，各处理用田埂隔开，试验田周围设1.0 m 保护行。黄芪管理措施与当地农户一致。

于黄芪落叶期进行样品采集，采样时间分别为2020 年10 月22 日 与2021 年10 月24 日。在 每个 小区按等距取样法选取3 个取样点，用铁锹采取黄芪植株与土壤样品。每个取样点采集3 株黄芪，放入塑封袋内保存，植株样品取样时尽量保持植株完整性；选择黄芪根际距地面5 cm 处土壤土样混匀风干，过筛待用。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 黄芪生长指标的测定 使用清水清洗植株表面泥土，吸水纸吸干水分，用卷尺与游标卡尺测定单株株高、根长、根径；然后使用烘箱105 ℃整株杀青10 min，65 ℃烘干至恒质量后使用万分之一分析天平称量根干质量。

1.4.2 黄芪药效成分含量的测定 烘干的样品用FW100 型高速万能粉碎机研磨成粉，过0.3 mm 筛。采用闪式提取法提取黄芪主要药效成分[13]，以芦丁为对照制测定黄酮含量的标准曲线，采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定总黄酮含量[14]。以黄芪甲苷为对照制测定皂苷含量的标准曲线，采用香草醛-浓硫酸比色法测定总皂苷含量[15]。以无水葡萄糖为对照制测定多糖含量的标准曲线，采用苯酚-硫酸比色法测定多糖含量[16]。

1.4.3 土壤养分的测定 参照《土壤农化分析》[17]，全氮含量采用半微量凯氏法测定，全磷含量采用钼锑抗比色法测定，全钾含量采用NaOH 熔融-火焰光度法测定，碱解氮含量采用碱解扩散法测定，速效磷含量采用0.5 mol/L NaHCO3法测定，速效钾含量采用乙酸铵浸提-火焰光度法测定。

1.4.4 土壤酶活性的测定 参照《土壤酶及其研究法》[18]，土壤脲酶活性采用苯酚钠-次氯酸钠比色法测定，土壤碱性磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法测定，土壤蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定。

1.5 数据处理

采用SPSS 25.0 对数据进行方差分析和差异性检验，数据结果采用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 菌Ⅴ拌种处理对黄芪生长的影响

由图1 可知，菌Ⅴ拌种后，黄芪株高、根长、根径和根干质量均显著大于对照。1年生黄芪株高、根径及根干质量与对照相比差异显著（P＜0.05），分别增加了1.97 cm、0.81 mm、0.38 g，较对照分别提高了12.37%、25.63%与82.61%，根长差异达极显著（P＜0.01），增加了3.53 cm，较对照提高了10.44%；2 年生黄芪株高、根长、根径与根干质量与对照相比均差异显著（P＜0.05），分别增加了5.57 cm、6.60 cm、1.50 mm 和1.13 g，较对照分别提高了14.76%、14.81%、15.94%和27.23%。2 年生黄芪与1 年生黄芪相比，菌Ⅴ处理各生长指标增加量均高于CK 增加量，CK 与菌Ⅴ的黄芪株高分别增加21.8、25.4 cm，根长分别增加10.77、13.84 cm，根径分别增加6.25、6.94 mm，根干质量分别增加3.69、4.44 g。

图1 菌Ⅴ拌种对黄芪单株生长的影响Fig.1 Effects of JUN V seed dressing on growth of Astragalus plant

2.2 菌Ⅴ拌种处理对黄芪药效成分的影响

由图2 可知，菌Ⅴ拌种后，黄芪黄酮、皂苷、多糖3 种药效成分含量均极显著高于对照（P＜0.01），1 年生黄芪黄酮、皂苷、多糖含量分别增加了0.31、1.09、7.85 mg/g，较对照分别提高了32.32%、23.71%和78.29%；2 年生黄芪黄酮、皂苷、多糖含量分别增 加了1.05、4.56、3.17 mg/g，较对照分别提高了99.20%、54.70%和18.75%。2年生与1年生黄芪相比，菌Ⅴ处理中黄酮和皂苷含量的增加量高于CK的增加量，多糖增加量小于CK，CK 与菌Ⅴ的黄酮含量分别增加0.11、0.86 mg/g，皂苷含量分别增加3.73、7.21 mg/g，多糖含量分别增加6.91、2.23 mg/g。

图2 菌Ⅴ拌种对黄芪药效成分的影响Fig.2 Effects of JUN Ⅴseed dressing on the content of medicinal components in Astragalus

2.3 菌Ⅴ拌种后黄芪种植地土壤氮磷钾含量的变化

由图3 可知，黄芪用菌Ⅴ拌种后，连续2 a 其种植地土壤氮、磷、钾含量均得到提高。与对照相比，菌Ⅴ拌种处理1 年生黄芪土壤全氮、碱解氮、速效磷含量与对照间差异极显著（P＜0.01），全磷、速效钾含量与对照间差异显著（P＜0.05），全钾含量与对照间差异不显著，其中，全氮、全磷、全钾含量分别增加了0.18、0.15、1.15 g/kg，较对照分别提高了33.96%、38.46%和5.63%，碱解氮、速效磷和速效钾含量分别增加了13.29、1.15、6.54 mg/kg，较对照分别提高了71.68%、13.08%和7.84%；2 年生黄芪根际土壤全氮、全磷、碱解氮、速效磷含量与对照间差异极显著（P＜0.01），速效钾含量与对照间差异显著（P＜0.05），全钾含量与对照间差异不显著，其中，全氮、全磷和全钾含量分别增加了0.20、0.26、0.42 g/kg，较对照分别提高了27.78%、63.41%和1.94%，碱解氮、速效磷和速效钾含量分别增加了16.10、0.56、7.39 mg/kg，较对照 分别提高了68.66%、5.30%和8.21%。2 年生与1 年生相比，菌Ⅴ处理组的全氮、全磷、碱解氮、速效钾含量增加量高于CK，全钾、速效磷含量增加量低于CK，菌Ⅴ与CK 全氮含量分别增加0.19、0.21 g/kg，全磷含量分别增加0.02、0.13 g/kg，全钾含量分别增加1.18、0.45 g/kg，碱解氮含量分别增加4.91、7.72 mg/kg，速效磷含量分别增加1.78、1.19 mg/kg，速效钾含量分别增加6.63、7.48 mg/kg。

图3 菌Ⅴ拌种对黄芪种植地土壤氮磷钾含量的影响Fig.3 Effects of JUN Ⅴseed dressing on the content of soil nitrogen，phosphorus and potassium in Astragalus planting area

2.4 菌Ⅴ拌种后黄芪种植地土壤酶活性的变化

从图4 可以看出，与对照相比，菌Ⅴ拌种后1 年生黄芪脲酶活性与对照间差异极显著（P＜0.01），碱性磷酸酶活性与对照间差异显著（P＜0.05），蔗糖酶活性与对照间差异不显著，其中，土壤脲酶、碱性磷酸酶和蔗糖酶活性分别增加了0.18、0.28、0.01 mg/（g·d），较对照分别提高71.58%、15.79%和7.80%；2 年生黄芪土壤脲酶与碱性磷酸酶活性与对照间差异显著（P＜0.05），蔗糖酶活性与对照间差异不显著，其中，脲酶、碱性磷酸酶和蔗糖酶活性分别增加了0.17、0.36、0.01 mg/（g·d），较对照分别提高了46.44%、15.65%和4.51%。2 年生与1 年生黄芪相比，对照与菌Ⅴ的黄芪土壤脲酶活性分别提高0.11、0.10 mg/（g·d），土壤碱性磷酸酶活性分别提高0.50、0.57 mg/（g·d），蔗糖酶活性均提高0.01 mg/（g·d）。

图4 菌Ⅴ拌种对黄芪种植地土壤酶活性的影响Fig.4 Effects of JUN Ⅴseed dressing on soil enzyme activity in Astragalus planting area

3 讨论

3.1 菌Ⅴ拌种促进了黄芪的生长及药效成分的积累

植物的生长指标与植物结构和产量性能有关，是评价植物健硕程度的重要指标，而黄芪主要以根入药，根长、根径、根干质量是评价黄芪产量的重要因素。本研究发现，接种菌Ⅴ后可以显著促进黄芪株高、根长、根径、根干质量增加，这是由于氮是植物叶片生长、叶绿素合成必不可少的元素，固氮菌的接种提高了土壤氮元素含量增加，使黄芪植株光合作用增强，有机物积累增加，促进了植株的生长。PENG 等[19]研究表明，将固氮菌接种水稻后，显著提高了水稻叶片的光合速率，并提高了产量。陈海荣等[20]研究表明，施加根瘤菌肥使紫云英株高平均增加8.20 cm，单株鲜质量平均增加0.64 g，公顷产量提高了7.7%，显著提高了紫云英的产量。

此外，菌Ⅴ拌种能显著促进黄芪药效成分黄酮、皂苷、多糖的积累，本试验在黄芪最佳采收期落叶期采样[21]，此时黄芪地上部分开始枯萎，能量与物质均向根部积累，能较好反映出黄芪植株全年的积累量。任建国等[22]用具固氮功能菌株的菌肥拌种处理太子参的种根，收获后分析太子参块根的生长发育与品质，结果表明，与未经菌肥处理的对照相比，菌肥处理过的太子参块根生物量明显增加；块根的氨基酸、皂苷含量及微量元素Mn、Fe 含量分别增加243.3%、119.8%、2.1% 和13.1%，而多糖、环肽含量及微量元素Cu、Zn 含量差异不大。本试验发现，拌种菌Ⅴ后1 年生黄芪多糖含量较对照提高了78.29%，这可能是由于黄芪生长的第1 年主要是根的生长，不会开花结荚，且黄芪根中多糖主要储存在木质部和韧皮部的薄壁细胞中，在周皮部位几乎没有黄芪多糖分布，形成层含有极少数的多糖[23]，拌种菌Ⅴ后黄芪根径显著增加，木质部与韧皮部厚度显著增加，故根中多糖含量较对照增加较多。同时试验还发现，拌种菌Ⅴ后2 年生黄芪含量较对照提高量较大，究其原因可能是由于试验中发现部分未施加菌Ⅴ的2 年生黄芪未开花。很多研究表明，开花会影响植物叶中的黄酮含量[24-25]，可能是因为未开花黄芪叶中黄酮含量较低，进而影响黄芪营养循环，导致落叶期根中黄酮的积累降低；同时，未开花的黄芪会将物质与能量主要集中在根部维管组织的发育[26-27]，而开花的黄芪需要进行开花结荚等一系列生理过程，植株的能量流向种子[28]，这可能是通过拌种菌Ⅴ后2 年生黄芪较1 年生黄芪多糖含量增加较少现象出现的原因。

3.2 菌Ⅴ拌种提高了黄芪种植地土壤氮磷钾含量

土壤氮磷钾是植物生长必不可少的重要元素，3 种元素的含量及比例是衡量土壤肥力高低最重要的指标之一，土壤氮磷钾的含量在很大程度上影响着作物的产量与品质。本试验发现，拌种菌Ⅴ后，土壤全氮、全磷、碱解氮、速效磷含量均有显著提高。分析其原因，固氮菌可以将空气中的氮气分子转化成可被植物利用的铵态氮与硝态氮，增加土壤中氮元素含量，同时降低环境pH 值，增加有机磷的有效性，从而提高磷的含量[29]。植物根际氮含量与磷含量可以互相促进，氮的增加可以间接影响磷的有效性，同时磷也可以通过刺激微生物和植物根系活动影响土壤中氮的保留和流失[30]。钾是植物生长的另一重要元素，本试验中拌种菌Ⅴ后，土壤全钾含量并无显著增加，但速效钾含量显著增加，这可能是因为土壤全钾仅仅反映土壤钾素储量并且主要受土壤矿物种类的影响，速效钾则是土壤中易被作物吸收的钾素，拌种菌Ⅴ无法改变土壤矿物种类，但会增加土壤中可被吸收利用的速效钾含量。韩光等[31]研究发现，施加固氮根瘤菌和根际促生菌菌肥可以显著提高苜蓿土壤中全氮、全磷、全钾、有效磷和速效钾的含量，并显著提高了苜蓿植株全氮含量。刘旭艳等[32]研究发现，接种固氮根瘤菌后苜蓿土壤全氮和速效氮含量显著增加，有效磷、速效钾和硫元素含量显著降低。本研究结果与他人的研究结果之间存在差异，这可能是因试验材料、固氮菌株与土壤类型等方面不同造成的。

多年生植物往往会持续影响土壤养分，如李金辉等[33]研究发现，紫穗槐根际无机磷和有效磷含量会随着种植年份的增加而增加。本试验同样发现，2 年生黄芪土壤氮磷钾含量均高于1 年生黄芪土壤，这与正月等[34]、陶波等[35]在大豆连种第1 年与第2 年的研究结果相同，同时，试验发现施加菌Ⅴ后，土壤全氮、全磷、碱解氮、速效钾增加量都大于对照，这说明黄芪是多年生豆科植物，随着年份的增加可以有效积累土壤肥力，拌种菌Ⅴ会加速豆科植物对土壤养分的积累。

3.3 菌Ⅴ拌种改变了黄芪种植地土壤酶活性

土壤酶是指土壤中具有生物催化能力的一些特殊蛋白质类化合物的总称，它们是土壤中植物、动物和微生物活动的产物，是反映土壤肥力的一个重要指标。土壤脲酶作为催化尿素水解的最重要的酶，可将酰胺态氮化物水解转化为无机形式的氮化物供植物直接吸收和利用，在植物生态系统的氮供应中起着重要作用[36]；土壤碱性磷酸酶则是将有机磷酸盐水解为无机形式的关键酶。本试验拌种菌Ⅴ后，土壤脲酶、碱性磷酸酶活性均显著提高，与张雪梅等[37]的研究结果一致。其原因一方面是固氮菌会向土壤中分泌相关的酶，促进自身的生长，另一方面可能是由于接种的固氮菌改善了土壤的微环境，一定程度上激活了土壤中其他有益的土著微生物，使其胞外酶释放含量增多[38]。蔗糖酶是一种水解蔗糖的重要土壤酶，能将蔗糖水解产生等摩尔的葡萄糖和果糖混合物，其活性可反映土壤有机碳的含量[39]。本试验发现，施加菌剂后蔗糖酶活性较低且与处理无显著差异，可能是由于土壤蔗糖酶活性与土壤有机质含量具有显著的相关性[40]，试验地定期人工除草但并不填埋，而腐殖质是土壤有机质的重要组成部分[41]，且试验地汾阳地区土壤有机质含量偏低[42]，故蔗糖酶活性较低，但这些推测还有待进一步研究验证。

4 结论

本试验结果表明，采用菌V 拌种，既促进了黄芪的生长与药效成分的积累，又提高了土壤养分水平和酶活性，可为黄芪专用菌肥的开发提供物质基础。