马晓凡+李林

摘要：在山东日照地区同时采集大豆[Glycine max （L.） Merr]、菜豆（Phaseolus vulgaris L.）根瘤，分离纯化，保藏根瘤菌共54株，通过提取DNA，PCR recA基因，通过Blast比对及recA基因的系统进化分析，研究日照地区大豆与菜豆根瘤菌遗传多样性。结果表明，在90%以上的相似水平上，日照大豆中的根瘤菌分布于根瘤菌属、慢生根瘤菌属、伯克霍尔德菌属3大属，圆明慢生根瘤菌、大豆慢生根瘤菌、菜豆根瘤菌、豌豆根瘤菌4个种，3个未定种。日照菜豆中的根瘤菌全部分布于根瘤菌属，菜豆根瘤菌、豌豆根瘤菌、赤小豆根瘤菌3个种，2个未定种，其中一个进化距离较远，可能为潜在新种。证明了日照大豆、菜豆根瘤菌丰富的遗传多样性，且日照大豆根瘤菌多样性大于日照菜豆。

关键词：大豆[Glycine max （L.） Merr]；菜豆（Phaseolus vulgaris L.）；根瘤菌；遗传多样性

中图分类号：S565.1；S643.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）15-2938-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.15.035

Abstract： The soybean[Glycine max （L.） Merr] and kidney bean（Phaseolus vulgaris L.） rhizobia were collected simultaneously，and a total of 54 rhizobia were separated， purified and then preserved. After the extraction of total DNA，the recA gene was amplified using PCR and the obtained sequences were blasted with those selected from genbank，and phylogenetic analysis was then done. The genetic diversity of soybean and kidney bean rhizobia from Rizhao was studied. At a similarity of more than 90%， soybean rhizobia from Rizhao were identified as Bradyrhizobium yuanmingense，Bradyrhizobium japonicum，Rhizobium phaseoli， Rhizobium leguminosarum，and other three undetermined species. They were affiliated with Rhizobium，Bradyrhizobium and Burkholderia. The kidney bean rhizobia from Rizhao were identified as Rhizobium phaseoli，Rhizobium leguminosarum，Adzuki bean rhizobia，and other two undetermined species， among which one species showing a remote evolutionary distance from the others was probably a potential new species. The results proved the high genetic diversity of soybean and kidney rhizobia from Rizhao and revealed that the soybean rhizobia were more diverse than the kidney bean rhizobia.

Key words： soybean[Glycine max （L.） Merr]；kidney bean（Phaseolus vulgaris L.）；rhizobia；genetic diversity

氮是植物所需要的大量元素之一。缺氮會导致植物生长缓慢，叶面积减少，分蘖减少，株高变矮，叶片发黄，甚至不能开花结果[1]。但当植物有充足的氮素营养时，叶绿素的形成会加快，叶色变深，叶面积增大，提高光合作用，促进植物生长和果实发育，因此氮对植物有至关重要的作用。农业生产需要大量的氮肥，但生产化学氮肥需要消耗大量化石燃料，产生大量污染物及温室气体的排放，造成环境污染，同时，也会产生巨大的经济压力。虽然氮气占空气体积的80%，但植物不能直接利用。自然界中有少部分固氮微生物可以将氮气固定转化成可被植物吸收利用的氨，即生物固氮[2]。根据固氮方式的不同，生物固氮分为自生固氮、共生固氮以及介于两者之间的联合固氮。每年全球生物固氮量达1.75×108 t，是工业氮肥产量的4.37倍[3]，其中2/3以上为共生固氮[4]。

生物固氮中效率最高的体系是根瘤菌和豆科作物间的共生固氮体系，其可为豆科作物提供一半以上的氮素营养，全球每年固定的氮素达到7千万t。除了供给宿主植物氮素，也能在土壤中留下大量的氮素，后续供给其他植物和微生物利用，对养地改土有很好的作用[5]，在农业的可持续发展和氮缺乏地区的生态环境修复中有重要作用[6]。此外，全世界大约1/5的蛋白食品是由豆科植物提供的[3]，因而研究豆科植物-根瘤菌固氮体系，探索新的根瘤菌种类与资源，保藏并科学利用根瘤菌基因资源，筛选相应的高效菌株并直接应用于农业生产与生态环境修复有重要意义。

根瘤菌作为高效共生固氮体系的主要成员，是自然界和农业系统中最有价值的微生物资源之一。因此，在农业生态系统中开展的大豆根瘤菌资源多样性研究，对揭示大豆根瘤菌种群及其多样性演变过程、高效根瘤菌株的选育和应用具有重要意义。本研究分析了日照地区大豆与菜豆根瘤菌遗传多样性，探索新的根瘤菌资源，为后续的根瘤菌筛选和育种工作提供参考。endprint

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

培养基：根瘤菌培养用YMA培养基（pH=7.0）。成分为甘露醇10.0 g、酵母粉3.0 g、KH2PO4 0.25 g、KH2PO4 0.25 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NaCl 0.1 g、琼脂粉15～20 g、去离子水1 L。

PCR试剂、琼脂糖凝胶电泳试剂购于上海生工生物工程技术服务有限公司；PCR扩增仪、高速离心机Eppendorf 5417R（美国Eppendorf公司）；DNA试剂盒购于上海生工生物工程技术服务有限公司；扩增引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；电泳仪；UV扫胶仪；生化培养箱；超净台；元素分析仪；原子吸收分光光度计；超低温冰箱等。

1.2 根瘤的采集

从多年种植大豆的同一块土地中，挖掘时用铁铲小心挖开大豆根部土壤，露出根系，每个点挑选个大饱满、呈浅粉色、新鲜的根瘤（带点根，以保证根瘤的完整），装入变色硅胶干燥管中盖严，做好标记，带回实验室进行分离。

日照菜豆的采样方式与日照大豆相同。

1.3 根瘤的分离、纯化、保存

用自来水将根瘤上泥土清洗干净后，95%的乙醇浸泡30 s以消除表面张力，倒出乙醇，再用0.2%的HgCl2浸泡2～5 min（视根瘤大小而定）进行表面消毒，最后用无菌水冲洗5～6次。将表面消毒过的根瘤分装到无菌的1.5 mL离心管中（每个1枚），用尖部烧钝冷却的黄枪头将根瘤捣碎，用移液枪将汁液吸取转到YMA平板上划线，做好标注后，置于28 ℃培养箱中倒置培养至单菌落出现。如无单菌落出现，要重新在YMA平板上划线，直至长出单菌落。革兰氏染色镜检合格的单菌落再次在YMA平板上划线，扩大培养，生长2～3 d后，收集菌体，一部分保藏于装有20%甘油的管中，一式两份，做好标记，装入冷冻盒，登记后于-80 ℃冰箱进行菌种保藏，另挑取一部分菌体于1.5 mL離心管中，做好标记后，装入冷冻盒，置于-20 ℃冰柜，用于DNA提取。

1.4 根瘤菌总DNA的提取，recA基因的扩增

根瘤菌总DNA提取采用细菌基因组DNA提取试剂盒，操作步骤依照说明书进行。提取的DNA做好标记，放入冷冻盒，-20 ℃保存。用于根瘤菌recA基因的扩增引物：正向引物recA 41F（5′-TTCGGC AAGGGMTCGRTSATG-3′）、反向引物recA 640R （5′-ACATSACRCCGATCTTCATGC-3′）。recA基因PCR 扩增体系（50 μL）：2× PCR Mix 25 μL，recA 41F（10 μmol/L）1 μL，recA 640R（10 μmol/L）1 μL，模板 DNA 1 μL，ddH2O 22 μL。扩增条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，32个循环；72 ℃ 5 min，4 ℃保持。

1.5 测序及分析

扩增的recA基因片段约为600 bp，取4 μL PCR产物，100 V，1.0%琼脂糖凝胶（含1 μg/mL荧光染料Genecolor）电泳40 min，检测PCR产物片段的长度和亮度，验证合格的送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将测序后的结果进行Blast比对，找出所属的物种及相似度。采用MEGA 5.0软件中的Clustal W功能，序列比对后，采用Maximum composite likelihood模型计算序列距离矩阵，并用邻接法（NJ）构建进化树进行聚类分析，自展值（bootstrap）为1 000。根据序列对、进化树及序列矩阵的相似性，将recA基因序列相似性为100%的定为同一基因型。

2 结果与分析

2.1 采样信息

于2015年10月对日照大豆和日照菜豆进行取样，分离根瘤数分别为56、53个，纯化菌株数分别为29、25株，PCR产物分别为12、13个。

2.2 电泳检测结果

选取的recA基因片段为500～800 bp，验证合格进行测序，其中25株可能属于根瘤菌。图1为recA基因片段电泳结果。

2.3 Blast比对结果

2.3.1 日照大豆比对结果 日照大豆中的根瘤菌分布于根瘤菌属、慢生根瘤菌属、伯克霍尔德菌属三大属。其中，根瘤菌属中，有菜豆根瘤菌、豌豆根瘤菌两个种；慢生根瘤菌属种中，有圆明慢生根瘤菌种、大豆慢生根瘤菌种，还有未确定种的两株；另外一种属于伯克霍尔德菌属，未确定种（表1）。

2.3.2 日照菜豆比对结果 日照菜豆的根瘤菌都分布于根瘤菌属，其中已确定的有3个种，分别为菜豆根瘤菌种、豌豆根瘤菌种、赤小豆根瘤菌种，有两个未定种（表2）。

2.4 recA基因型系统发育分析

2.4.1 日照大豆recA基因系统进化树分析 根据日照大豆recA基因系统进化树（图2），结果与Blast比对结果基本一致。RD001与RD004不属于根瘤菌，所以与其余菌株进化关系较远。其余菌株里，分为两大进化分支。其中一支包括RD003、RD007、RD008、RD009、RD011、RD010，对比Blast比对结果，即全部属于慢生根瘤菌属，该分支又分为3小支，RD003、RZ007、RZ008、RZ009属于同一小支，相似性很大，很可能属于同一种；另一支包括RD002、RD005、RD006，其中RD005、RD006进化关系较近，对比Blast比对结果，属于根瘤菌属；RD002属于单独另一小分支，对比Blast比对结果，属于伯克霍尔德菌属，可能与根瘤菌属关系很近。

2.4.2 日照大豆recA基因系统进化树分析 根据日照菜豆recA基因系统进化树（图3），结果与Blast比对结果基本一致。RC001、RC003、RC005、RC006、RC010、RC011、RC014属于同一分支，根据Blast比对，属于根瘤菌属菜豆根瘤菌；RC012、RC013进化水平基本一致，很可能属于同一种；RC002、RC004、RC007、RC009属于同一种，即根瘤菌属豌豆根瘤菌；RC008单独在一分支，进化距离较远，很可能为一个潜在新种。endprint

3 小结与讨论

根瘤菌是革兰氏阴性细菌，广泛分布于土壤中，虽然它们的起源相同[7]，但由于受环境胁迫以及宿主植物选择的影响，进化方向各异，经过长期的演变形成表型与遗传型的高度多样性。表型多样性是细菌基因差异的体现，虽然在一定程度上通过表型分析能够反映根瘤菌间的遗传差异，但始终很难全面地反映全部的基因特征。而遗传多样性研究包括两个层面，一是基因组水平上的，二是对特殊基因酶切图谱及序列测定分析。

本研究采用Blast对比及recA基因的系统进化分析对来自中國日照地区的54株大豆、菜豆根瘤菌的遗传多样性进行比对研究。将54株根瘤菌在较低相似性值水平上分为3个群，分属于根瘤菌属、慢生根瘤菌属、伯克霍尔德菌属。其中大豆菌株，分布于3个属，4个种，3个未定种。菜豆菌株全部分布于根瘤菌属，下分3个种及2个未定种。由此可以看出，日照大豆根瘤菌的遗传多样性远远大于日照菜豆。

在细菌分类和进化研究中，16S rDNA序列测定与分析已成为所有分类单元中必需的分析项目和首选的分子标记，在数据库中积累了大量可供比对和新种鉴定的序列资料。由于16S rRNA基因序列具有高度的保守性，其在根瘤菌研究中不足以区分进化关系比较近的种。16S rRNA基因在细菌种或属间存在横向转移及重组也会造成某些菌株鉴定的不确定性[8]。同一株菌株中可能存在16S rRNA基因的不同拷贝，序列不完全一样。因此，在根瘤菌种群的划分、种内遗传多样性和系统发育研究中持家基因的分析做补充是很有必要的。随着基因测序技术的发展，多基因序列的测定和分析已成为新的发展趋势。越来越多全基因组序列测定的完成将会使基于基因组水平的系统发育的建立成为可能。

参考文献：

[1] 李春俭.高级植物营养学[M].北京：中国农业大学出版社，2008.

[2] 徐清平.氮循环与固氮[J].中学生物学，2005，21（3）：11-13.

[3] 林稚兰，黄秀梨.现代微生物学与实验技术[M].北京：科学出版社，2000.

[4] 陈文新，李阜棣，闫章才.我国土壤微生物学和生物固氮研究的回顾与展望[J].世界科技研究与发展，2002，24（4）：6-12.

[5] 陈文新，汪恩涛，陈文峰.根瘤菌-豆科植物共生多样性与地理环境的关系[J].中国农业科学，2004，37（1）：81-86.

[6] 徐开未，张小平，陈远学，等.凉山州新银合欢根瘤菌的共生有效性及遗传多样性[J].微生物学报，2014，54（5）：498-508.

[7] 陈文峰，陈文新.我国豆科植物根瘤菌资源多样性及应用基础研究[J].生物学通报，2003，38（7）：1-4.

[8] WERNEGREEN J J，RILEY M A. Comparison of the evolutionary dynamics of symbiotic and housekeeping loci：A case for the geneticcoherence of rhizobial lineages[J].Molecular Biology and Evolution，1999，16（1）：98-113.endprint