李永荟，舒相华，袁 红，解水梅，耿志诚，张王芝，林钧艺，宋春莲

（云南农业大学动物医学院，云南昆明650201）

近年来，随着生猪养殖不断朝向规模化发展，多种疾病混合感染的现象愈发频繁，对猪场常见疾病诊断与防控提出了新要求。猪圆环病毒病（PCVD）和猪蓝耳病（PRRS）均为免疫抑制性疾病，可导致母猪繁殖障碍疾病以及仔猪和育肥猪呼吸系统疾病[1-2]；猪支原体肺炎（MPS）是一种发病率高、病死率低的猪慢性呼吸道传染病[3]；大肠杆菌可引起仔猪白痢、仔猪黄痢、猪水肿病、败血症及新生仔猪腹水等多种疾病，发病率和病死率均较高[4-5]；猪葡萄球菌病能够引起渗出性皮炎，以哺乳仔猪和保育猪易发，发病率为10%～90%，病死率可达到70%左右[6]；沙门氏菌病主要表现为败血症和坏死性肠炎，一年四季均可发生，按病程可分为急性、亚急性、慢性型，4月龄内的猪易感[7]。

目前针对PRRS、PCVD、猪瘟（CSF）等疾病，临床常用检测方法如ELISA、PCR 等能够快速有效地进行诊断[3,8]。有研究表明，感染猪蓝耳病病毒（PRRSV）的情况下，发生与猪圆环病毒2（PCV-2）混合感染的概率高于其他传染病[9]。PRRSV 与PCV-2 混合感染后可引发机体免疫系统紊乱和免疫抑制以及炎症反应，导致其他细菌或病毒混合感染的概率升高。若存在多种病毒病混合感染且伴随肠道细菌感染并扩散至其他内脏，可出现二次感染造成猪死亡[10-11]，增加猪的病死率。目前尚无针对病毒性疾病有效药物和方式治疗，养殖场仍以疫苗接种方式进行预防。本试验对云南某猪场发生的PCV-2、PRRSV、猪肺炎支原体（Mhp）与大肠杆菌、葡萄球菌和沙门氏菌的混合感染病例进行实验室诊断，为养殖场提供防治建议。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样本采集

来自云南省镇沅县某猪场的100头母猪血样、60头保育猪血样以及2头保育猪新鲜脾脏和肺脏组织。

1.1.2 试剂与仪器

主要试剂：PRRSV、PRV-gB、PRV-gE、PCV-2-dCap、猪瘟病毒（CSFV）阻断ELISA 抗体检测试剂盒（武汉科前生物股份有限公司）；核酸提取试剂、反转录试剂（宝生物工程（大连）有限公司）；琼脂糖凝胶（北京擎科生物科技有限公司）。

主要仪器：酶标仪（广州秦思科学仪器有限公司）、烘干箱（上海一恒科学仪器有限公司）、离心机（艾本德股份公司）、PCR 扩增仪（耶拿公司）、电泳仪（北京六一仪器厂公司）、凝胶成像分析仪器（北京六一生物科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 抗体检测

取全血待血液凝固，4 000 r/min 离心10 min，收集血清。使用ELISA 抗体检测试剂盒对160 份血样进行CSFV、PCV-2、PRRSV、PRV-gB、PRV-gE 的检测，方法参考试剂盒说明书。

1.2.2 病原检测

分别从100头母猪和60头保育猪中各随机抽取5份血样（共10份），2头保育猪肺脏和脾脏组织。

10 份血样和2 头保育猪组织分别采用本实验室建立的PCR 方法进行检测鉴定PCV-2、PRRSV、PRV、Mhp、CSFV、胸膜肺炎放线杆菌（APP）、副猪嗜血杆菌（HPS）和巴氏杆菌（PeP）的病原。鉴定引物均由本实验室设计，上海生工生物科技有限公司合成。各鉴定引物序列见表1。

表1 病毒与细菌核酸检测引物序列Tab.1 Primer sequences for virus and bacterial nucleic acid detection

1.2.3 细菌分离培养

2头保育猪新鲜脾脏和肺脏组织分别在LB培养基、麦康凯培养基、SSS培养基和血平板进行细菌分离培养后染色镜检。

1.2.4 组织病理切片观察

将新鲜的脾脏、肺脏浸泡于10%甲醛溶液固定，修块、梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制成厚度为4 μm的连续切片；烤片干燥，采用二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，苏木素染色，盐酸酒精分色，自来水冲洗淡化；伊红酒精染色，酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下观察，拍照记录组织病理学变化。

2 结果与分析

2.1 不同病毒抗体水平检测结果（见图1）

由图1 可知，母猪和保育猪PRV-gB、PSSRV、CSFV、PCV-2 免疫抗体阳性率均高于90%；保育猪PRV-gB、PCV-2 免疫抗体阳性率高于90%，CSFV 抗体阳性率高于80%，PRRSV 免疫抗体阳性率仅为46.70%。母猪和保育猪的PRV-gE抗体阳性率均为0。

2.2 病原检测结果（见图2～图4）

由图2～图4 可知，5 份母猪血样PCR 检测PRRSV、PRV、PCV-2、CSFV、PeP、Mhp、HPS 和APP 病原的结果均为阴性。5头保育猪血样和2头保育猪组织PCR检测结果分别为：1 头保育猪血样和1 头保育猪组织PCV-2 阳性，5 头保育猪血样和2 头保育猪组织PRRSV 均为阳性，1 头保育猪组织Mhp阳性。

2.3 细菌分离培养染色镜检结果（见图5）

2头保育猪组织细菌分离培养后，LB培养基上有乳白色光滑菌落生长。

由图5 可知，2 头保育猪组织均存在大肠杆菌，其中1头组织存在葡萄球菌，另1头存在沙门氏菌。

2.4 病理组织切片结果（见图6）

由图6 可知，低倍镜下可见猪肺脏呼吸部整体结构发生破坏；高倍镜下可见肺泡内充满红色黏液，存在出血现象，肺泡囊消失，肺泡巨噬细胞减少，Ⅰ型细胞和Ⅱ型细胞变形。低倍镜下可见脾脏小梁变宽，间质、窦腔增宽，红髓区与白髓区界限不清，脾小体消失，呈明显出血现象；高倍镜下可见脾脏淋巴细胞变小，浆细胞变大。

3 讨论

随着我国集约化和规模化养殖增多，多病原混合感染的情况也日益增多。PRRS和PCVD均为能够造成免疫抑制而导致免疫应答不充分的猪群常见疾病。近年来，PRRSV和PCV混合感染的案例有所增加并引起了人们的广泛关注。当PRRSV 和PCV 进入猪体内，可相互促进病毒复制，导致猪群出现严重的呼吸道症状和繁殖障碍疾病[12]。有研究表明，PRRSV 和PCV 的混合感染不仅能够侵害呼吸系统，还可降低机体免疫力，引起生长发育迟缓，进而导致支原体肺炎、胸膜肺炎等细菌病的混合感染概率升高[13-14]。

本研究中，该猪场出现PRRSV、PCV、Mhp 与葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌混合感染的情况。有研究表明，保育猪在感染PRRSV 和PCV 后存在分别与沙门氏菌、葡萄球菌、支原体发生混合感染的情况[15-16]，发生大肠杆菌的继发感染的情况则在仔猪中较为常见[17]。上述结论与本研究结果中出现混合感染情况有所不同，可能由于该猪场的猪群在出现PRRSV 和PCV 的混合感染后免疫力下降，且场内环境清洁不到位、养殖密度大等导致继发支原体、沙门氏菌、葡萄球菌和大肠杆菌感染。

研究表明，在发生PRRSV和PCV的混合感染后，肺小叶间质增宽，充满大量红色浆液，小血管和毛细血管扩张，充满红细胞，肺泡腔内有大量红染浆液和纤维蛋白[18-19]；脾脏实质细胞坏死明显，小梁尚可分辨，脾小体轮廓不清，但淋巴细胞和网状细胞崩解、碎裂，在白髓和红髓均可见大量红细胞蓄积和巨噬细胞增生[20-21]。上述病理变化与本研究中病例剖检所见相同。

本试验中，母猪群抗体检测结果均免疫合格，保育猪PRRSV 免疫抗体阳性率低于80%，为免疫不合格，结合抗原检测有PRRSV检出，表明猪场已经感染该病，保育猪免疫抑制引起免疫抗体不合格和发病；PCV-2免疫抗体阳性率均高于90%，结合有抗原检出，表明免疫抗体可能是野毒感染所致；PRV-gE抗体阳性率为0，抗原检测未检测到病原，表明该场内不存在PRV野毒感染情况。

4 结论

经检测，该猪场存在PRRSV、PCV、Mhp、大肠杆菌、沙门氏菌和葡萄球菌的混合感染，建议猪场加强生物安全消毒工作，同时使用抗生素结合提高免疫力的药物进行治疗与保健。PRRS 和PCVD 均为免疫抑制性疾病，建议发病猪隔离治疗，发病期间不接种任何疫苗。结合该猪场出现的混合感染情况，可通过投喂黄芪多糖等药物进行大疗程抗病毒或提高免疫力的药物保健，并建议该猪场针对抗体水平低于80%的猪，及时查找免疫失败的原因，猪群疾病症状好转后及时对疫苗接种做出调整和补种疫苗；并针对细菌感染种类配合使用1～2疗程头孢类、喹诺酮类的抗生素进行治疗。同时，注意环境消毒清洁工作，注意饲养管理，避免出现应激。