陈 鑫，陈 侃

(上海交通大学医学院附属第九人民医院，上海 200011)

急性冠脉综合征是以动脉粥样硬化为病理基础的炎性疾病，具有很高的致残率和致死率[1].白细胞介素-1β(IL-1β)是促炎性细胞因子，主要由活化的单核巨噬细胞合成并分泌[2].动脉粥样硬化斑块不稳定是急性冠脉综合征发生的重要机制，IL-1β可通过诱导趋化因子释放，促进单核细胞、嗜中性粒细胞在粥样硬化部位聚集，加速病变进展[3]；同时刺激巨噬细胞大量释放炎性因子，增加斑块不稳定型[4].研究[5]发现：IL-1与IL-1受体平衡状态的改变参与冠状动脉粥样硬化的发生与发展，其中，IL-1β启动子区-1470基因多态性与冠心病(特别是心肌梗死)密切相关，但关于对急性冠脉综合征发病易感性影响的研究仍十分少见，因此，本研究主要探讨IL-1β启动子区-1470基因多态性与急性冠脉综合征发病易感性的相关性.

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取上海交通大学医学院附属第九人民医院2019年3月—2020年5月收治的急性冠脉综合征患者90例为研究组.其中，男51例，女39例；年龄53～71岁，平均(60.85±8.19)岁.根据病变类型分为不稳定型心绞痛组46例，心肌梗死组44例；心肌梗死患者中急性非ST段抬高型心肌梗死24例，急性ST段抬高型心肌梗死20例.收集同期行冠脉造影检查且结果正常者45例为对照组，其中，男25例，女20例；年龄51～70岁，平均(60.27±7.53)岁.上述受试者之间无亲缘关系.本研究获得医院伦理委员会批准(批号：2018-XNLL-09).

入选标准：符合中国急性冠脉综合征急诊速诊指南(2016版)中的诊断标准，经皮冠脉造影检查显示冠脉狭窄程度≥50%；理解能力正常；自愿参与本研究.

排除标准：肝肾功能严重不全的患者；合并恶性肿瘤、严重感染性疾病、心瓣膜病、免疫系统功能严重异常的患者.

1.2 主要仪器和试剂

伯乐T100 PCR基因扩增仪(Bio-Rad公司，美国)；E-Gel Imager凝胶成像仪(赛默飞公司，美国)；高速离心机(长沙综仪生物科技有限公司)；全自动生化分析仪(贝克曼公司，美国)；血液DNA快速提取试剂盒(上海莱枫生物科技有限公司)；IL-1β检测试剂盒(艾美捷科技有限公司).

1.3 方 法

1.3.1 血清标本采集及生化指标检测

分别抽取受试者的清晨空腹外周静脉血4 mL和3 mL，其中4 mL装入含血清分离胶促凝管中用于检测生化指标，另外的3 mL装入EDTA抗凝管中用于分离基因组DNA.取4 mL外周血标本，4 000 r/min离心10 min，收集血清，使用全自动生化分析仪检测空腹血糖、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白水平；酶联免疫吸附法检测血清可溶性IL-1β.

1.3.2 基因组DNA提取和基因型检测

取3 mL外周血标本，使用血液DNA快速提取试剂盒抽提基因组DNA，-80 ℃保存待测.查询美国国家生物技术信息中心提供的IL-1β启动子区-1470前后约500 bp序列，使用Premier软件进行引物设计，由武汉金开瑞生物工程有限公司合成.上游引物：5′-TCTTCTCCCTAACGACCTAG-3′，下游引物：5′-TTCCAATCTCCCA CCACCTC-3′.PCR反应体系30 μL，包括Master Mix 15 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、DNA模板5 μL、双蒸馏水8 μL.扩增条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性30 s，55 ℃复性10 s，72 ℃复性10 s，共40个循环，72 ℃延伸10 min，扩增产物共418 bp.琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物的特异性，之后将产物送至武汉金开瑞生物工程有限公司进行测序分析.

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 研究组与对照组人口学特征及临床资料

研究组患者吸烟率、合并高血压和糖尿病比例以及空腹血糖、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白水平均明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)；性别、年龄在两组间比较差异无统计学意义(P>0.05).见表1.

表1 研究组与对照组人口学特征及临床资料Tab.1 Demographic characteristics and clinical data between the study group and the control group

2.2 PCR扩增结果及IL-1β启动子区-1470基因T/C位点测序分析

对PCR扩增产物行琼脂糖凝胶电泳显示：在418 bp处均出现IL-1β启动子区-1470基因条带.见图1.采用双脱氧测序法测定IL-1β启动子区-1470基因多态性位点基因型，测序结果显示存在TT、TC、CC3种基因型.见图2.

M.1 000 bp； 1～8均含有IL-1β启动子区-1470基因条带(316 bp).图1 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified products

A～C.IL-1β启动子区-1470基因TT基因型、 TC基因型、CC基因型.图2 IL-1β启动子区-1470基因T/C位点测序图谱Fig.2 T/C site sequencing map of IL-1β promoter region-1470 gene

2.3 研究组与对照组IL-1β启动子区-1470基因多态性分布情况

研究组患者中IL-1β启动子区-1470 TT基因型的比例明显低于对照组，CC基因型的比例明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)；研究组患者中T等位基因频率明显低于对照组，C等位基因频率明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.01).见表2.

表2 研究组与对照组IL-1β启动子区-1470基因多态性分布Tab.2 Polymorphism distribution of IL-1β promoter region-1470 gene between study group and control group

2.4 急性冠脉综合征发病易感性与IL-1β启动子区-1470基因多态性的相关性分析

非条件Logistic回归校正性别、年龄、吸烟、高血压、血糖、血脂，分析急性冠脉综合征发病易感性与IL-1β启动子区-1470基因的相关性，结果显示：与对照组比较，IL-1β启动子区-1470 CC基因型携带者患急性冠脉综合征、不稳定型心绞痛、心肌梗死的风险分别高出TT基因型携带者的3.35倍、3.14倍、3.58倍；C等位基因携带者患急性冠脉综合征、不稳定型心绞痛、心肌梗死的风险分别高出T等位基因携带者的1.74倍、1.68倍、1.79倍.见表3.

表3 急性冠脉综合征发病易感性与IL-1β启动子区-1470基因多态性的相关性Tab.3 Correlation of susceptibility to acute coronary syndrome and IL-1β promoter region-1470 gene polymorphism

2.5 血清可溶性IL-1β水平分析

研究组IL-1β启动子区-1470基因型为TT、TC、CC的患者血清可溶性IL-1β浓度均明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)；研究组、对照组中TC基因型和CC基因型与TT基因型比较差异均无统计学意义(P>0.05).见表4.

表4 研究组与对照组血清可溶性IL-1β水平Tab.4 IL-1β serum soluble level between study group and control group

3 讨 论

急性冠脉综合征是冠心病的一种严重亚型，病情呈进行性发展.IL-1家族基因主要聚集在人染色2的400 kb区域，能够编码IL-1α、IL-1β及其内源性受体拮抗剂[6].相关研究[7]显示：IL基因多态性可通过调控IL-1与IL-1受体的平衡，参与急性冠脉综合征炎症反应的发生与发展.亦有研究[8]发现：IL-1是作为一个重要的促炎性细胞因子，参与动脉粥样硬化斑块的形成，其中IL-1β启动子区-1470基因多态性与动脉粥样硬化的严重程度密切相关[9].在上述研究基础上，本研究进一步探讨了IL-1β启动子区-1470基因多态性与急性冠状动脉综合征发病易感性的关系，旨在为阐明急性冠状动脉综合征的发病机制提供依据.

本研究显示：研究组患者中IL-1β启动子区-1470 TT基因型的比例明显低于对照组，CC基因型的比例明显高于对照组；其中CC基因型携带者患急性冠脉综合征的风险提升3.35倍，C等位基因携带者患急性冠脉综合征的风险是T等位基因携带者的1.74倍.研究[10]发现：CC基因型和TC基因型会增加急性冠脉综合征的遗传易感性.但本研究中仅发现CC基因型与急性冠脉综合征发病易感性明显相关，与上述研究结论存在差异，其原因可能为急性冠脉综合征的发生受多种环境因素和遗传因素的共有影响[11-12].本研究纳入的对象在地域环境方面存在差异，可能使基因多态性对疾病的影响有所不同.进一步分析显示：IL-1β启动子区-1470 CC基因型和携带C等位基因是不稳定型心绞痛、心肌梗死发生的危险因素，有望成为不稳定型心绞痛和心肌梗死的预测指标.

IL-1β启动子区-1470基因T/C位于IL-1β转录起始位置上游852 bp处，该位点T等位基因向C等位基因的突变可能影响转录因子的结合，进而影响IL-1β的表达水平[13].研究[14]发现：CC和TC基因型的冠心病患者外周血单核细胞IL-1β mRNA表达水平较TT基因型明显升高.亦有研究[15]显示：基因型为CC和TC的急性心肌梗死患者外周血单核细胞中IL-1β mRNA表达水平明显高于基因型为TT的患者.但本研究检测了急性冠脉综合征患者外周血清可溶性IL-1β浓度显示：CC和TC基因型的急性冠脉综合征患者血清IL-1β浓度与TT基因型之间无明显差异.其可能的原因：IL-1β启动子区-1470基因T/C SNP不影响IL-1β表达，或可能仅影响细胞膜中的IL-1β表达，对血清中IL-1β表达无明显影响[16].此外，本研究中急性冠脉综合征患者血清IL-1β浓度明显高于对照组，提示IL-1β与急性冠脉综合征的发生相关.

综上所述，IL-1β启动子区-1470基因多态性与急性冠脉综合征的发生密切相关，其中，IL-1β启动子区-1470 CC基因型是急性冠脉综合征的危险因素，增加了发病易感性.但本研究未深入探讨IL-1β启动子区-1470基因多态性影响急性冠脉综合征发病易感性的分子机制，在后续的研究中将进一步探讨相关信号通路和调控机制.