阎赟梦，叶亚菲，毛红丽

（郑州大学第一附属医院检验科，河南省检验医学重点实验室，河南 郑州 450052）

肝细胞癌是原发性肝癌中最常见的亚型［1］。在全球范围内，肝癌在癌症相关死亡的最常见原因中排名第四，在发病病例中排名第六。根据世界卫生组织的年度预测，到2030年，估计将有100多万人死于肝癌［2］。肝癌的5 a存活率为18%，是仅次于胰腺癌的第二大恶性肿瘤［3］。肝癌多发生于肝硬化患者。由于存在局部晚期和转移性疾病，许多肝癌患者错失手术切除治疗的良机。大多数肝癌的基因组、表观遗传学和代谢水平都极其复杂，很难找到有效的治疗方案，而且其化疗治疗进展也非常缓慢［4－5］。因此，探讨肝癌发生的关键促癌分子机制将有助于确定特异性的诊断和预后生物标志物，并为患者分层和治疗指导提供新的视角［6］。

长链非编码RNA（long non－coding RNAs，lncRNAs）是一类长度超过200个核苷酸的非蛋白编码RNA，在肿瘤中起着重要的调节作用［7－8］。越来越多的证据表明，lncRNA在肿瘤的发生、发展中起着关键的调控作用［9］。小核仁RNA宿主基因20（small nucleolar RNA host gene 20，SNHG20）被认为是许多人类肿瘤潜在的预后生物标志物，并与多种肿瘤临床病理特征密切相关［10］。本研究旨在探讨SNHG20在肝癌中的综合作用，并强调其与免疫的关系，以期为肝癌提供一种新的预后生物标志物。

1 材料与方法

1.1 数据采集从TCGA数据库中分析374个肝癌组织样本信息，该数据库包含肝癌患者的临床信息和基因表达谱。排除总生存时间数据缺失或不足的病例，纳入所有既有表达又有临床信息的样本。根据SNHG20表达的中位数将肝癌患者分为SNHG20高表达（187例）和低表达（187例）。

1.2 生存与表达分析采用R语言研究SNHG20在肝细胞癌中的表达与临床病理特征的关系并评价SNHG20对肝癌患者预后的影响。用Boxplots分析SNHG20在不同组间的差异表达。

1.3 肝癌组织中免疫细胞浸润水平为了计算SNHG20表达与免疫细胞浸润程度的相关性，采用R分析［11］。用Pearson相关分析判断肿瘤纯度和SNHG20表达之间的关系。通过Spearman相关分析，计算了6种不同类型免疫细胞的免疫浸润程度与SNHG20表达水平之间的关系［12］。

1.4 基因集富集分析采用基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）4.0.3软件进行富集分析，将SNHG20的高、低表达水平归类为表型文件，所有转录组数据均作为表达数据文库，替换试验次数为1 000次。富集结果使用归一化富集得分＞1.5作为显著富集的筛选标准［13］。

1.5 CIBERSORT法检测肿瘤浸润免疫细胞在肝癌中的免疫应答CIBERSORT（http：／／cibersort.Stanford.edu／）可以计算肿瘤浸润性免疫细胞的丰度。使用CIBERSORT对肝癌中肿瘤浸润免疫细胞的免疫应答进行量化，以评估其与SNHG20表达水平和存活率的关系［14］。

1.6 统计学分析采用R 3.6.3软件包进行整合和结构化。对SNHG20表达与临床病理因素的相关性进行logistic回归分析。此外，单因素和多因素Cox分析揭示研究人群中的独立预后变量。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SNHG20在肝癌中表达及其与临床病理特征的关系TCGA数据库分析表明，相比于癌旁组织，SNHG20在肝癌组织中的表达呈现上调的趋势。见图1A。SNHG20的高表达与T分期、病理分期、肿瘤状态、体质量、血管侵犯和总生存期有相关性（P＜0.05）。见表1。

图1 SNHG20在肝癌组织和癌旁组织中的差异表达

表1 TCGA数据库中的肝癌患者临床病理参数和SNHG20表达之间的关系［n（%）］

表1（续）

2.2 SNHG20表达与肝癌预后的关系进一步生存分析结果显示：与SNHG20低表达的肝癌患者比较，SNHG20高表达组肝癌患者的总体生存时间、疾病特异性生存期、无复发生存期时间缩短。见图2A、B、C。

图2 SNHG20表达与肝癌预后的关系

2.3 单因素和多因素Cox回归分析将患者年龄、性别、SNHG20表达水平、病理分级、TNM 分期纳入Cox模型进行单因素及多因素分析。结果显示，在单因素的Cox比例风险回归模型分析中，SNHG20高表达是肝癌患者预后不良的危险因素（风险比率＝1.662，P＝0.004）。见表2。为了排除其他临床病理的干扰，进行了多因素的Cox比例风险回归模型分析。结果提示，SNHG20高表达、TNM分期是影响肝癌患者不良预后的独立危险因素，其风险比率分别为1.591和1.788。见表3。

表2 SNHG20表达与肝癌患者临床病理因素的单因素Cox分析

表3 SNHG20表达与肝癌患者临床病理因素的多因素Cox分析

2.4 SNHG20表达与肿瘤浸润免疫细胞的关系肿瘤浸润淋巴细胞水平被认为是影响癌症患者生存的独立预测因子。图3显示了22个免疫细胞亚群的比例在SNHG20高低表达的分布情况，其中T细胞、浆细胞样树突状细胞、自然杀伤细胞、CD56dim自然杀伤细胞、CD56bright自然杀伤细胞、中性粒细胞、肥大细胞、并指状细胞、树突状细胞、细胞毒细胞、B细胞、辅助性T细胞、Tgd细胞、Th17细胞、Th2细胞及调节下T细胞在SNHG20高低表达的富集得分差异有统计学意义（P＜0.05）。

图3 22种免疫细胞亚群的比例在肝癌组织SNHG20高低表达的分布情况

2.5 肝癌组织中SNHG20的表达与免疫浸润程度之间的关系图4表明SNHG20表达与免疫细胞浸润水平的相关性。肝癌组织中SNHG20的表达水平与细胞毒细胞（r＝－0.290，P＜0.001）（图5A）、树突状细胞（r＝－0.320，P＜0.001）（图5B）、中性粒细胞（r＝－0.370，P＜0.001）（图5C）与自然杀伤细胞（r＝－0.250，P＜0.001）浸润水平呈负相关（图5D）。

图4 SNHG20表达与免疫浸润水平的相关性

图5 肝癌组织中的SNHG20表达与细胞的相关性

2.6 SNHG20差异表达富集的基因集基因富集分析结果显示高SNHG20表达富集KEGG DNA复制、KEGG细胞周期信号通路、KEGG Wnt信号通路。低SNHG20表达具有KEGG胰岛素信号通路的富集。

图6 SNHG20差异表达基因的GSEA分析

3 讨论

SNHG20在肿瘤的发展过程中起着重要的作用，SNHG20抑制剂可以作为抗癌治疗的候选药物［15］。然而，SNHG20在肝细胞癌中的潜在预测作用的信息很少。本研究通过分析SNHG20在肝癌组织中的表达情况，进一步对SNHG20在肝癌中的可能作用进行了研究。研究结果表明，SNHG20的表达水平与肝癌患者的T分期、病理分期、组织学分级、肿瘤状态和血管侵犯有关。SNHG20的高表达与肝细胞癌预后不良有关。

多因素Cox回归分析表明SNHG20高水平表达是肝癌患者不良预后的独立预测因子。在肝细胞癌中，SNHG20的表达与免疫浸润水平之间存在显著联系。CIBERSORT研究表明，SNHG20的表达与肝细胞癌的免疫浸润程度有关。肝癌组织中SNHG20的表达与B细胞、T细胞、细胞毒细胞、树突状细胞、中性粒细胞和自然杀伤细胞的浸润程度呈负相关。此外，几种免疫细胞基因标志物的表达与SNHG20的相关性提示SNHG20在肝癌的肿瘤免疫微环境调节中具有重要作用。所有这些结果都表明SNHG20高水平表达与免疫力下降之间有很强的相关性。

通常，关于TIICs效应的证据主要集中在人类肿瘤中的T细胞上［16－17］。越来越多的研究表明T细胞水平总数升高是肿瘤患者有利的预后因素之一［18］。此外，B细胞可以影响卵巢癌和乳腺癌的总体存活率［19］。先前的一项研究表明，B细胞、T细胞的基因表达以及BCR片段之间存在极高的相关性［20－21］。免疫信号在免疫细胞类型之间存在着很强的相关性，这表明肿瘤免疫浸润是多样性、一致性和可预测性［22－23］。因此，SNHG20对肝癌的作用可能与B细胞和T细胞的浓度有关。

GSEA分析表明，在SNHG20高表达表型中，KEGG DNA复制、KEGG细胞周期和KEGG Wnt信号通路显著富集。而在SNHG20低表达表型中，KEGG胰岛素信号通路明显富集。所有这些结果都表明SNHG20可能被用作肝癌的预测和治疗靶点。研究结果进一步证实了SNHG20与肝细胞癌的免疫浸润和预后之间的联系。分析结果表明，SNHG20对肝细胞癌中的细胞毒细胞、树突状细胞、中性粒细胞和自然杀伤细胞的免疫浸润有显著影响。细胞毒细胞（r＝－0.290，P＜0.001）、树突状细胞（r＝－0.320，P＜0.001）、中性粒细胞（r＝－0.370，P＜0.001）、NK细胞（r＝－0.250，P＜0.001）与SNHG20表达呈显著负相关。

SNHG20是一种不编码蛋白质的RNA。既往研究结果表明，SNHG20在肝细胞癌的发生和发展中起着关键作用［10，24－26］。但SNHG20介导肝癌发生发展的具体机制尚不清楚。Zhang等［27］表明，SNHG20过表达导致肝癌的不良预后，在肝细胞癌的发展中发挥了作用，与本研究分析结果一致。因此，有理由相信SNHG20将影响肝细胞癌的病理生理机制的发展，基于研究结果和先前的SNHG20研究，但目前还不能全面地解释SNHG20与肝细胞癌免疫浸润之间的关系。

综上，SNHG20是肝细胞癌预后分子标志物。SNHG20可能调控的肝癌关键通路包括KEGG胰岛素通路、KEGG Wnt信号通路、KEGG细胞周期和KEGG DNA复制信号通路。进一步的研究表明，肝癌组织中SNHG20的表达与B细胞、T细胞、细胞毒细胞、树突状细胞、中性粒细胞和自然杀伤细胞的浸润程度呈显著负相关，SNHG20在肝癌的肿瘤免疫微环境调节中具有重要作用。关于SNHG20影响肝癌发生发展的具体机制仍需要进一步研究。