倪鲁波，唐雷鸣，陆羚子，戴意飞，刘婷，蒋玲波

舟山市食品药品检验检测研究院（舟山 316000）

黄曲霉毒素（aflatoxin，AF）[2]是自然界中最常见且毒素最强的真菌毒素，AF根据荧光颜色、结构不同可分为B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、R1、GM等。其中，AFB1毒性最强，M1和G1次之[3]。AF能通过食物转移到人类及动物体内残留且极难代谢，因此对人类生命安全颇具威胁。谷物及其制品粮油作物及加工产品、果蔬产品、乳及乳制品、鱼禽肉制品、动植物饲料等都检出AF，其中花生和玉米及其制品最容易受到污染[3]。AF结构性质稳定，对光、热和酸均稳定，耐高温，一般加热温度很难破坏其结构，只有达到其熔点时才能使其分解[3]。在自然条件下能长时间存在，对人类危害较大。由于AF对人类的危害性非常大，世界各国都相应出台AF的限量标准值和检测标准[4]。因此，需要用最精确及高效的检测技术对AF进行测定确保其准确性[5]。

该方法简便快捷，而且具有响应值高、平行好、分离效果好、数据可靠等优点。使用SMART柱全自动净化分析系统直接串联检测器减少试验前处理中人员操作，大幅降低人员操作中黄曲霉毒素带来风险，且提高试验效率，减少试验过程中待测物质的损失。所以，试验研究并建立乳制品中AFM1和AFM2提取净化、上机分析一体化的检测技术，创建一种简捷高效、灵敏度高，重现性好的检测方法，为AFM1、AFM2的检测提供新的发展方向与思路。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

大容量落地高速冷冻离心机（AVANTIJ-E）；超纯水机（赛多利斯科学仪器有限公司）；多样品涡旋混合器（广州得泰仪器科技有限公司）；Waters高效液相色谱仪ACQUITY Arc（美国Waters公司）；SMART-柱全自动净化分析联机（德国LCTech公司）；免疫亲和柱（北京振翔科技有限公司）。

黄曲霉毒素M1（AFM1）、黄曲霉毒素M2（AFM2）标准溶液：北京振翔科技有限公司；磷酸氢二钠十二水（Na2HPO4·12H2O）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）：北京振翔科技有限公司；甲醇、乙腈（色谱纯，国药）。

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件

Waters Bridge C18柱（4.6 mm×150 mm，2.5 μm）色谱柱；柱温箱35 ℃；流速0.6 mL/min，进样量50 μL；流动相为V水∶V甲醇∶V乙腈溶液=70∶15∶15；激发波长360 nm，发射波长430 nm。

1.2.2 标液和试剂的配制

1.2.2.1 标准溶液的配制

分别取0.1 mL AFM1、AFM2标液（10 mg/L）至10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度。配制成100 ng/mL的AFM1、AFM2混合标准储备液。配制液密封于0～4 ℃环境下储存。临用时按实际需求加入初始流动相稀释至所需浓度的标准曲线工作液，标准工作液现配现用。

1.2.2.2 磷酸盐缓冲溶液（PBS）的配制

称取2.92 g Na2HPO4·12 H2O+8.0 g NaCl+0.2 g KH2PO4+0.2 g KCl后，加入900 mL水使固体溶解。用盐酸调节至pH 7.4，加水定容至1 000 mL。

1.2.3 提取方法

准确称取1.00 g样品于50 mL离心管中，加入4 mL热水溶解，混匀，加入10 mL（V甲醇∶V水=3∶1）振荡提取10 min。在4 ℃，以6 000 r/min离心10 min，取10 mL上清液加入40 mL PBS稀释，涡旋2 min使其充分混匀，上免疫亲和柱净化处理。

1.2.4 净化洗脱方法

使用SMART免疫亲和柱对稀释后的提取液进行净化洗脱处理[2]，将SMART免疫亲和柱放在免疫亲和柱架盘上。拧掉SMART免疫亲和柱密封盖和堵头，柱子里面的缓冲溶液会缓慢排出，直到缓冲溶液液面达到柱床处。按需求取适量稀释液上柱，并控制稀释液过柱流速在1.0 mL/min左右，让所有样液都流过柱子[1]。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

选用Waters Bridge C18柱进行分析检测，并对乙腈、甲醇、水等流动相的比例进行重新组合测试，考察AFM1、AFM2保留时间、灵敏度及峰形，分离度等因素，从而选取最优的流动相体系。该法优化流动相比例和流速，将流动相比例调整为V水∶V甲醇∶V乙腈溶液= 70∶15∶15、流速0.6 mL/min。从图1标准图谱可以看到，AFM1、AFM2和乳制品中的干扰物质都能很好地分离，AFM1、AFM2峰形相对尖锐，灵敏度高。且在10 min内就能完成检测分析。因此，该方法通过优化流动相比例和流速，不仅能使AFM1、AFM2分离良好，而且缩短检测分析时间，大幅提高效率。

图1 AFM1和M2标准色谱图

2.2 提取试剂的优化

考察不同比例的甲醇溶液作为提取试剂对AFM1、AFM2回收率的影响。以V甲醇∶V水=1∶1，2∶1，3∶1和4∶1作为提取溶剂，分别通过仪器检测分析并比较回收率。由图2可知，通过比较回收率后发现，在甲醇含量50%～75%时，随着甲醇含量增加，目标物回收率逐步上升。但在甲醇含量75%～80%时，目标物回收率反而开始下降。由此得知，75%甲醇水溶液为最佳提取液。

图2 不同比例甲醇溶液作为提取试剂对样品中AFM1、AFM2回收率的影响

2.3 方法的线性关系、精密度及检出限

AFM1、AFM2在0.05～5 ng/mL范围内标准曲线线性较好，相关系数大于0.999，阴性样品做加标试验，分别加入3个浓度且每个浓度做6组平行试验，结果如表1所示。2种目标物回收率在83.2%～90.0%之间，SRSD为1.0%～2.7%，方法检出限（≥仪器信噪比3倍）AFM1为0.02 μg/kg，AFM2为0.01 μg/kg。该方法简捷效率，分离度好，响应值高，重现性好。

表1 乳粉中AFM1、AFM2回收率和RSD结果（n=6）

3 结论

此次试验主要通过改良提取试剂的比例、SMART柱在线净化条件、流动相比例，建立SMART柱在线自动净化-高效液相串联荧光检测法同时检测黄曲霉毒素（AF）M1、M2的方法，使试验中AFM1、AFM2分离度更好，出峰更快，响应值更高，从而提高试验回收率和试验效率。其中，真菌净化平台直接串联液相荧光检测器的使用，直接大幅降低试验前处理中的人员操作风险并且大幅缩短前处理时间，为真菌毒素的试验前景拓展新思路。