闵祥博，汤纯，矫艳平，余萍，赵迪

江西仁仁健康产业有限公司（樟树 331200）

乳糖（lactose）是雌性哺乳动物特有的一种二糖，仅存在于乳汁中；乳糖无法被人体吸收，在肠道内被一种消化酶——乳糖酶消化分解成能被人体吸收的葡萄糖和半乳糖[1]。

乳糖酶（lactase）又称β-半乳糖苷酶（β-galac-tosidase），是位于人体小肠绒毛的一种消化酶[2]，乳糖酶是由小肠黏膜表面绒毛的顶端处分泌，在所有双糖酶中成熟最晚、含量最低，最易受损，修复又最慢[3]；该酶可催化分解乳糖，同时乳糖酶还具有半乳糖苷的转移作用。

乳糖不耐受症（lactose intolerance，LI）是指与乳糖不完全消化相关的胃肠道症状，即由于小肠上皮细胞乳糖酶（也称β-半乳糖苷酶）缺乏，乳制品中的乳糖不能被分解吸收，从而进入结肠，被肠道细菌分解后，产生大量短链脂肪酸和氢气，造成渗透压升高，使肠腔内的水分增多，引起腹痛、胀气和腹泻等消化不良症状，称为乳糖不耐受症[4]。

乳糖不耐受症的机制尚不清楚，除了乳糖酶缺乏，还包括乳糖消化量、胃肠道传送、直肠动力异常、性别、年龄等因素[5]。除表现为乳糖不耐症之外，还存在乳糖代谢不良但不表现出症状的人群，通常称为乳糖吸收不良（lactose malabsorption，LM），即二糖消化不良，进而导致乳糖不耐受。乳糖不耐症与乳糖吸收不良合称为乳糖酶缺乏（lactase deficiency，LD）。乳糖酶缺乏是一种广泛存在的世界性问题，影响全世界近2/3的人口，亚洲患病率高达95%，LD对人类的健康造成很大的威胁[6]。既往研究显示[7-8]，含乳糖饮食可以有效提高钙质吸收，相反地，无乳糖饮食会降低钙质吸收率。乳糖不耐受，特别是无乳糖饮食可能会导致骨盐沉积不充分等健康问题。乳糖不耐受症的治疗主要方式有添加乳糖酶，饮食调理，应用益生菌等。现如今关于解决乳糖不耐受问题的方法，均还有待完善。如食用低（无）乳糖制品，但无法长期满足患者营养需求[9]；口服乳糖酶通常需要长期治疗且价格昂贵，且胃内pH等因素均会影响乳糖酶的功效[10]；而改变基因又相对复杂且技术不成熟，仍处于试验阶段[11]。因此，应用益生菌缓解乳糖不耐受症的研究就显得尤为重要。

研究表明多种益生菌可产生乳糖酶[12-13]，同时可延缓胃排空速率，减慢肠转运时间[12]，改善肠道微生态平衡[14]。双歧杆菌、乳酸杆菌能酵解乳糖，在酵解乳糖时只产酸不产气，不增加渗透压，同时增加肠道短链脂肪酸的吸收，有利于减轻乳糖不耐受症状。另有研究表明，所有双歧杆菌均具有乳糖酶，且活力显著高于其他肠道菌群，因此适量补充双歧杆菌可预防和缓解乳糖不耐受病症的发生[15]。试验通过测定益生菌菌株的β-半乳糖苷酶酶活和小鼠小肠的β-半乳糖苷酶酶活，研究动物双歧杆菌乳亚种HCS04-002对缓解乳糖不耐受症的益生作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试验菌株

动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalissubsp.Lactis）HCS04-002及其冻干菌粉、鼠李糖乳杆菌HCS01-008、罗伊氏乳杆菌HCS02-004、植物乳杆菌HCS03-012、嗜热链球菌HCS07-002、发酵乳杆菌HCS08-027、德氏乳杆菌保加利亚亚种HCS10-002、副干酪乳杆菌HCS17-044、瑞士乳杆菌HCS23-055：江西仁仁健康产业有限公司；动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalissubsp.lactis）HCS04-002菌株：2020年3月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.19509。

1.1.2 试验动物

清洁级昆明种（KM）小鼠50只，5周龄，18～22 g，雄性。小鼠饲料为无菌块状鼠料，均由辽宁长生生物技术有限公司提供。

1.1.3 主要培养基及培养条件

乳杆菌MRS培养基配方（液/固）：酵母蛋白胨1%，牛肉粉0.3%，酵母浸出物0.4%，磷酸二氢钾0.2%，柠檬酸0.2%，乙酸钠0.5%，葡萄糖2%，硫酸镁0.058%，硫酸锰0.025%，吐温-80 0.06%，番茄汁1%（V/V），琼脂2%，调至pH 6.50；115 ℃，30 min灭菌。

乳杆菌MRS-lac培养基配方（液）：酵母蛋白胨1%，牛肉粉0.3%，酵母浸出物0.4%，磷酸二氢钾0.2%，柠檬酸0.2%，乙酸钠0.5%，乳糖2%，硫酸镁0.058%，硫酸锰0.025%，吐温-80 0.06%，番茄汁1%（V/V），调至pH 6.50；115 ℃，30 min灭菌。

培养条件：37 ℃，固体培养36～48 h，二级为单菌落至5 mL培养基培养20 h，三级为菌液5%接种量于100 mL培养基中培养17 h，正常培养。

双歧杆菌培养基配方（液/固）：酵母蛋白胨3%，酵母浸出物2%，葡萄糖2.5%，低聚果糖0.5%，L-苹果酸0.5%，调至pH 7.20，（琼脂2%）115 ℃，30 min灭菌。

双歧杆菌MRS-lac培养基配方（液）：酵母蛋白胨3%，酵母浸出物2%，乳糖2%，L-苹果酸0.5%，调至pH 7.20；115 ℃，30 min灭菌。

培养条件：39 ℃，固体厌氧培养36～48 h，二级为单菌落至5 mL培养基培养20 h，三级为菌液5%接种量于100 mL培养基中（装液量100%）培养17 h，盖锡纸培养。

1.1.4 主要试剂

邻硝基酚（ONP，分析纯AR，MACKLIN）；磷酸二氢钾（KH2PO4，分析纯AR）、三水磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O，分析纯AR）、二水EDTA（C10H14N2Na2O8·2H2O，分析纯AR）、2-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG，生化试剂BR）、无水碳酸钠（Na2CO3，分析纯AR）（均为中国医药集团有限公司）；全脂乳粉（齐齐哈尔菲格瑞斯食品有限公司）。

1.1.5 主要仪器与设备

恒温培养箱（DHP-500BS，北京市永光明医疗仪器有限公司）；厌氧工作站（LAI-3DT，上海龙跃仪器设备有限公司）；低温高速离心机（TGL-16M，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；超声波细胞粉碎机（SCIENTZ-ⅡD，宁波新芝生物科技股份有限公司）；酶标仪（Multiskan FC，赛默飞世尔科技公司）。

1.2 试验方法

1.2.1β-半乳糖苷酶的测定

按照GB/T33409—2016《β-半乳糖苷酶活性检测方法分光光度法》[16]并参考文献[17-18]方法进行改进。

1.2.1.1 标准曲线的绘制

称取0.1390 g邻硝基苯酚（ONP）于小烧杯中，加10 mL 96%乙醇溶解，将溶液转移入1 L容量瓶中，加水定容摇匀。

用移液管分别从这些溶液中移取2，4，6，8，10，12和14 mL溶液至不同100 mL容量瓶中，各加入25 mL碳酸钠溶液，用缓冲液定容摇匀，制成0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12和0.14 mmol/L的ONP，用无菌水作空白。

以邻硝基苯酚的浓度为横坐标，以稀释液的吸光度ΔA420nm为纵坐标做标准曲线，得出回归方程。

1.2.1.2β-半乳糖苷酶活力的测定试验（ONPG法）

将培养17 h后的发酵液15 mL于10000 r/min 4 ℃离心5 min。收集菌泥，用等体积的0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.80）洗涤2次。将菌体重悬于3 mL上述磷酸盐缓冲液中，进行超声破碎。破碎条件：超声功率200 W、工作时间/间隔时间1 s/9 s、60次、4 ℃。10 000 r/min 4 ℃离心20 min取上清液，即得粗酶液。将粗酶液进行适当稀释，取粗酶液200 μL于30 ℃下水浴预热5 min，加入同样在30 ℃预热5 min的ONPG溶液1 mL，摇匀，在30 ℃下水浴10 min，立即加入400 μL碳酸钠溶液来终止反应。30 min内于420 nm处测定OD值。

反应缓冲液的配制：称取8.8 g磷酸二氢钾（KH2PO4）、8.0 g三水磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O）、0.25 g七水硫酸镁（MgSO4·7H2O）和18.6 mg二水EDTA（C10H14N2Na2O8·2H2O）溶解于900 mL水中，转入1000 mL容量瓶中，用水定容并摇匀，缓冲液的pH应在6.50±0.05之间。

ONPG底物溶液的配制：将250.0 mg邻硝基苯-β-D-半乳糖苷（o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG）溶解在约80 mL反应缓冲液中，接着转移到100 mL的容量瓶中，用反应缓冲液定容，摇匀，最早在用前2 h制备。

碳酸钠溶液的配制：将50 g碳酸钠（Na2CO3）和37.2 g二水EDTA溶解在约900 mL水中，定容至1000 mL。

空白样的制备：将添加ONPG底物和碳酸钠溶液的顺序颠倒，其余步骤与样品处理方式相同。

1.2.1.3 试验结果计算方法

1个酶活力单位（E）定义为：在30 ℃每分钟水解释放1 μmoL ONP所需的酶量。按式（1）计算酶活E（U/mL）。

式中：E为发酵液中酶活力，U/mL；f为测定酶液的稀释倍数；V为反应体系总体积，1.6 mL；K为标准曲线斜率，3.162 5；t为反应时间，10 min；V1为酶液体积，0.2 mL。A420nm为在420 nm波长处的吸光度。

1.2.2 小鼠小肠乳糖酶测定试验

1.2.2.1 小鼠分组灌胃

将4周龄的雄性KM小鼠（20.0±2.0 g）饲养于鼠笼中，保持温度25±0.5 ℃，相对湿度50%±5%，并执行12 h/12 h的灯光/黑暗循环。所有小鼠给予相同量的基本膳食，并提供足够的饮用水，适应性喂养1周后开始试验。小鼠随机分为5组：对照组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，分别经口灌胃纯水、12%全脂乳粉溶液、12%全脂乳粉和益生菌粉混合溶液（详见表3），益生菌菌粉灌胃剂量分别为1，2和4 g/kg体重（即每100 mL 12%全脂乳粉溶液中分别添加10，20和40 g益生菌菌粉），灌胃体积为10 mL/kg，灌胃量根据灌胃前每只小鼠的体重调节。每天上午灌胃1次，在灌胃28 d的24 h后，处死小鼠进行后续分析，每组小鼠10只[19]。每日记录小鼠的体重，观察其摄食量和饮水量是否正常，精神状态、活跃程度和皮毛光泽是否发生异常[20]。

表1 各试验组与对照组设置

1.2.2.2 小鼠小肠乳糖酶的测定

摘取KM小鼠小肠测定其乳糖酶活性。具体操作为：处死小鼠，立即取其胃幽门以下小肠肠段作为待测标本，用移液管取预冷的0.85%冷生理盐水，其体积总量应是小肠重量的9倍，用超声波细胞粉碎机（SCIENTZ-ⅡD）于冰浴中低速匀浆1 min，匀浆时间10 s/次，间隙30 s，连续6次，在冰（水）中进行，然后低温以3 000 r/min离心10 min取上清液。将上清液进行适当稀释，取上清稀释液200 μL于30 ℃下水浴预热5 min，加入同样在30 ℃预热5 min的ONPG溶液1 mL，摇匀，在30 ℃下水浴10 min，立即加入400 μL碳酸钠溶液来终止反应。30 min内于420 nm处测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 菌株β-半乳糖苷酶活性测定

对自有9株乳酸菌菌株进行β-半乳糖苷酶酶活测定，测定结果详见表2。动物双岐杆菌乳亚种HCS04-002的β-半乳糖苷酶酶活最高，酶活为0.758 U/mL。有研究表明双歧杆菌可以产生乳糖酶[21-22]，试验表明动物双岐杆菌乳亚种HCS04-002可明显产β-半乳糖苷酶。因此，选用动物双歧杆菌乳亚种HCS04-002进行后续的小鼠试验。

表2 各菌株β-半乳糖苷酶酶活数据

2.2 小鼠小肠β-半乳糖苷酶活性测定

乳糖酶是动物体内消化分解乳糖的主要酶源。由图1可知，全脂乳粉和益生菌的加入，使小鼠小肠内容物β-半乳糖苷酶的活性高于对照组，且具有统计学差异（p＜0.05），可见动物双歧杆乳亚种HCS04-002可促进小肠中β-半乳糖苷酶的恢复和增加。动物双歧杆菌乳亚种HCS04-002低剂量组试验小鼠小肠的β-半乳糖苷酶活性高于对照组的，但与模型组相比无显著差异；中剂量组和高剂量组试验小鼠小肠的β-半乳糖苷酶活性明显高于对照组和模型组，说明在此剂量下HCS04-002对乳糖不耐受有一定调节能力。

图1 各组别小鼠小肠β-半乳糖苷酶活性

3 结论

试验结果表明，动物双岐杆菌乳亚种HCS04-002可以产生β-半乳糖苷酶且酶活较高；经28 d的动物双歧杆乳亚种HCS04-002处理后，剂量达到2 g/kg时，小鼠小肠的β-半乳糖苷酶活性明显升高，说明动物双歧杆乳亚种HCS04-002表现出有一定的缓解乳糖不耐受的功能。试验发现，2 g/kg剂量组和4 g/kg剂量组之间没有表现出明显的酶活量效关系，这可能与该株菌缓解乳糖不耐受机理或者给样时间较短有关。试验仅对给样后KM小鼠小肠的β-半乳糖苷酶酶活进行测定，后续可增加测定小鼠脏器指数、血清和肝脏指标、小肠指标等，还可以考虑通过16SrRNA测序，分析小鼠结肠内容物的微生物菌群的多样性和丰度的变化等[23-24]，以期更全面地了解动物双歧杆乳亚种HCS04-002缓解乳糖不耐受症的机理，为进一步开发和应用提供数据支持。