陈 陈，佘媛媛，熊苏婉，杨 成

（1.皖南医学院临床学院，安徽 芜湖 241002；2.皖南医学院微生物学与免疫学教研室，安徽 芜湖 241002）

芽孢杆菌作为一种重要菌种资源，可产生多种类型的抗菌成分，包括脂肽类、胞外蛋白和抗菌多肽等，表现出对肠道致病菌抑制活性，从而起到调节肠道菌群平衡、防治消化道疾病以及提高机体免疫力等多重作用，在医药、食品及饲料添加剂等领域发挥着重要作用[1-3]。自Johnson等[4]在1945年报道枯草芽孢杆菌可以产生抗菌活性物质以来，后续多种抗菌活性成分陆续被分离出来，且对多种病原微生物具有抑制活性[5-7]。金黄色葡萄球菌在临床上常引起化脓性感染，是一类重要的食源性病原体，可引发食物中毒。随着大量抗生素的不合理使用，耐药性金黄色葡萄球菌菌株出现的概率呈现逐年上升的趋势[8-10]。目前，国内关于车前草内生菌的研究主要集中在内生真菌方面[11-15]，有关车前草内生芽孢杆菌拮抗金黄色葡萄球菌尚未见报道。高地芽胞杆菌CQC1是本实验室从车前草组织中分离获得的一株对金黄色葡萄球菌等多株革兰氏阳性菌产生较强抑制作用的活性菌株，且主要活性成分为抗菌肽类物质，而这些肽类物质往往能够造成细胞膜的损伤，导致细胞内容物外泄而具有广谱抗菌、抗病毒、抗原虫和抗肿瘤等活性[16]。本实验利用不同方式对菌株CQC1 胞外抗菌肽进行提取，考查其对金黄色葡萄球菌的抑制效果和稳定性，同时通过考查活性肽对金黄色葡萄球菌细胞膜结构影响来探讨其作用机制，为高地芽胞杆菌CQC1的开发应用提供基础研究。

1 材料与方法

1.1 供试菌和病原菌

高地芽胞杆菌CQC1，从车前草组织中分离鉴定，本实验室；金黄色葡萄球菌，本实验室。

1.2 培养基

NA 固体培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.4～7.6。NA 液体培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化钠5 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.4～7.6。种子/发酵培养基（液体PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1000 mL，自然pH。

1.3 菌株CQC1抗菌肽的制备及活性检测

1.3.1 菌株CQC1种子及摇瓶培养发酵

将菌株CQC1 接种于50 mL PDA 液体培养基中，37℃、180 r/min 培养24 h 作为种子。按10%体积比接种到装有200 mL 发酵培养基中，37℃、180 r/min 培养48 h。然后12000 r/min 离心30 min，弃沉淀，取上清液用于抗菌肽提取物的制备。

1.3.2 菌株CQC1抗菌肽的提取[17]

1.3.2.1 正丁醇提取

取100 mL 上述发酵上清液，加入100 mL 正丁醇，两种溶液充分混合后静置过夜（12 h），用分液漏斗分离得到正丁醇，重复一次，60℃下旋转蒸发浓缩正丁醇，用水溶解旋转蒸发得到的沉淀，冷冻干燥得到正丁醇提取物。

1.3.2.2 氯仿提取

取50 mL 上述发酵上清液，加入50 mL 氯仿，两种溶液充分混合后静置过夜（12 h），分离出氯仿层，55℃下旋转蒸发浓缩氯仿，用水溶解旋转蒸发得到的沉淀，冷冻干燥得到氯仿提取物。

1.3.2.3 硫酸铵饱和沉淀法

取50 mL 上述发酵上清液并向其中缓慢加入100% 饱和度的硫酸铵，边加边搅拌。待全部溶解后，置于4℃下静置过夜，12000 r/min 离心30 min，保留沉淀，用蒸馏水溶解后冷冻干燥得抗菌肽提取物。

1.3.3 抗菌肽提取物的抗菌活性测试

采用牛津杯法：将保存的金黄色葡萄球菌在营养平板上培养24 h，用接种环取一环转接到50 mL NA 液体培养基37℃、180 r/min 培养24 h，用无菌棉签直接取少许培养物均匀涂布于NA固体培养基表面，然后放入牛津杯，并让其自然下沉后，将上述制备的抗菌肽配制成浓度为5 mg/mL 的溶液，并用无菌0.22 μm 过滤除菌，吸取150 μL 作为活性测试样品加入牛津杯中，轻轻移至37℃恒温培养箱培养24 h，观察抑菌圈，并测量抑菌圈直径。重复3 次，取平均值作为该样本抑菌结果。

1.4 正丁醇相抗菌肽提取物的理化性质测定

1.4.1 温度稳定性测定

将装有10 mL 抗菌肽提取物的试管分别置于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃和100℃中处理1 h，121℃处理30 min，以未处理的样品为对照，采用牛津杯法测量菌落直径，处理及计算方法同1.3.3，每处理3 次重复。

1.4.2 酸碱稳定性测定

将10 mL 抗菌肽溶液分别调pH 值为1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0 ，在常温下处理1 h后，再调回pH为7.0，以未处理的样品为对照，采用牛津杯法测量菌落直径，处理及计算方法同1.3.3，每处理3次重复。

1.4.3 水解酶稳定性测定

将10 mL 抗菌肽溶液分别与等体积的胰蛋白酶溶液、蜗牛酶溶液和胃蛋白酶溶液混匀（各种酶终浓度为1 mg/mL），于37℃水浴锅中反应60 min，4℃冷却。以未处理的样品为对照，采用牛津杯法测量菌落直径，处理及计算方法同1.3.3，每处理3次重复。

1.5 菌株CQC1抗菌肽对金黄色葡萄球菌细胞膜的损伤

1.5.1 大分子释放量的测定

参照文献[18]方法，将金黄色葡萄球菌培养至对数期（24 h），用NA 液体培养基重悬后，加入菌株CQC1 抗菌肽，使其终质量浓度为5 mg/mL（处理组），对照组加入等体积的无菌水，于37℃、180 r/min 摇床培养，每隔2 h 取10 mL 菌悬液，6000 r/min 离心10 min 后弃沉淀，分别测定上清液在260 nm和280 nm波长处的吸光度。每组3次重复，数据取平均值。

1.5.2 β-半乳糖苷酶活力的测定

参照文献[19]，取金黄色葡萄球菌培养至对数期菌液，混合后分为抗菌肽处理组和对照组。抗菌肽处理组测3 个浓度，最终质量浓度分别为1 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL；对照组加等量无菌水，37℃培养箱中处理1 h后，分别吸取1 mL，12000 r/m 离心10 min，取上清液，加入4 mL 0.05 mol/L ONPG，37℃水浴40 min，然后加入0.5 mol/L Na2CO35 mL 终止反应，420 nm 处测量其OD 值。重复3次，计算平均值。

1.6 统计分析

实验数据采用方差分析，组间两两比较采用S-N-K检验，数据以xˉ±S 表示，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 菌株CQC1 发酵液不同提取方式获得抗菌肽提取物抗菌活性的比较

高地芽胞杆菌发酵液中抗菌活性成分一般为抗菌肽类及蛋白类物质[20]，而对该类活性成分的提取最常用的方法为硫酸铵饱和沉淀法、有机溶剂萃取及酸沉淀法。硫酸铵饱和沉淀法比较适用于大分子肽类及蛋白类，酸沉淀一般适用于脂肽类物质，而有机溶剂提取主要根据极性不同而分别提取不同极性的物质，如正丁醇属于极性有机溶剂，适合于极性物质提取，而氯仿属于中低极性有机溶剂，适合提取极性小的物质[21-23]。结果，不同提取方式提取的菌株CQC1 抗菌肽对金黄色葡萄球菌抑制效果也不尽相同，见图1 所示，从抑菌直径可以看出，正丁醇提取物对金黄色葡萄球菌的抑制效果最好，平均直径达到（28.6±0.2）mm；其次是硫酸铵饱和沉淀法提取的抗菌肽，对金黄色葡萄球菌也显示明显抑制作用，平均抑菌圈直径为（19.7±0.4）mm；而氯仿提取物效果最差，没有形成明显的抑菌圈，表明抗菌物质属大极性类物质。

图1 不同提取方式对金黄色葡萄球菌的抑制效果Fig.1 Inhibition effect of different extraction methods on Staphylococcus aureus

2.2 菌株CQC1正丁醇提取抗菌肽提取物的稳定性

2.2.1 热稳定性试验

将抗菌肽提取物分别用40℃～121℃共8 个温度处理，结果见表1所示，随着处理温度的升高，不同温度处理后的抗菌肽提取物抑菌活性之间存在一定的差异，且具有统计学意义（F=29.073，P＜0.05）。组间两两比较，经S-N-K 检验显示40℃、50℃、60℃、70℃、80℃及对照组（CK）相比之间差异不具有统计学意义（P＞0.5），60℃与90℃、100℃处理组间相比差异不具有统计学意义（P＞0.5），在121℃下抑菌活性与CK 相比，活性为85.7%，降低了14.3%。

2.2.2 酸碱稳定性试验

抗菌肽提取物经6个不同pH 处理后，其稳定性结果见表1 所示，经不同酸碱处理后，抗菌肽提取物抑菌活性之间相比差异有统计学意义（F=40.466，P＜0.05）。经S-N-K 检验显示，pH 分别为1.0、3.0、5.0、9.0时组间两两比较差异不具有统计学意义（P＞0.5），pH=7.0与对照组相比差异不具有统计学意义（P＞0.5）。表明该抗菌肽在酸性、中性或偏碱性环境中都比较稳定，在强碱性环境中稳定性有所下降。

2.2.3 水解酶稳定性试验

抗菌肽提取物被胰蛋白酶、蜗牛酶和胃蛋白酶处理，表现出抑菌活性之间相比差异有统计学意义（F=34.028，P＜0.05），经S-N-K 检验显示，蜗牛酶和胃蛋白酶处理间比较差异不具有统计学意义（P＞0.5），结果见表1。

表1 温度、pH和蛋白酶对菌株CQC1正丁醇抗菌肽提取物的影响（n=3）Tab.1 Effect of temperature，pH，proteases on antimicrobial peptide extract from strain CQC1

2.3 菌株CQC1抗菌肽对金黄色葡萄球菌细胞膜的损伤

2.3.1 大分子释放量分析

细胞内物质的泄漏是细胞膜通透性改变或破损的重要指标之一，因此，可以通过检测胞内的核酸、蛋白质等大分子物质泄漏情况，间接地反映细胞膜的损伤程度。金黄色葡萄球菌经抗菌肽提取物处理后胞内核酸和蛋白质的泄漏情况如图2 所示。随着时间的延长，处理组核酸和蛋白释放量都高于对照组，尤其在4 h 之后，相比于对照组，二者差距逐渐增大，核酸释放量急剧上升，与对照组相比差异有统计学意义（F=85.361，P＜0.05），见图2A。而蛋白释放量相比于对照组，增加得比较平缓，与对照组相比差异有统计学意义（F=31.852，P＜0.05），见图2B，且不同时间处理组差异有统计学意义（P＜0.05），表明该抗菌肽能通过改变金黄色葡萄球菌细胞膜的通透性，引起膜内物质泄漏到胞外，进而达到诱使菌体死亡的目的。

图2 抗菌肽提取物对金黄色葡萄球菌胞内大分子释放量的影响Fig.2 Effect of antimicrobial peptide extract on intracellular macromolecule release of Staphylococcus aureus

2.3.2 抗菌肽提取处理后对金黄色葡萄球菌菌液中β-半乳糖苷酶活力变化的影响

β-半乳糖苷酶位于细胞膜内，正常情况下不会向细胞外分泌，但如果细胞膜的通透性增大，β-半乳糖苷酶就可能从胞内释放到细胞外，因此，通过检测培养液中β-半乳糖苷酶活性可间接反映细胞膜的通透性[19]。经不同浓度抗菌肽作用后菌液中β-半乳糖苷酶活力测定结果见图3。抗菌肽浓度在1 mg/mL 时，处理组和对照组β-半乳糖苷酶活力基本没有变化，表明胞内β-半乳糖苷酶未出现外漏，差异不具有统计学意义（F=0.865，P＞0.05）；当抗菌肽浓度高于5 mg/mL 时，菌液中β-半乳糖苷酶活性开始升高，与对照组相比，差异具有统计学意义（F=25.536，P＜0.05），表明大量的β-半乳糖苷酶从胞内泄漏到菌液中。低浓度（1 mg/mL）与中浓度（5 mg/mL）处理组和高浓度（10 mg/mL）处理组相比差异有统计学意义（P＜0.05）；中浓度（5 mg/mL）处理组和高浓度（10 mg/mL）处理组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。

图3 金黄色葡萄球菌培养液中β-半乳糖苷酶活力测定Fig.3 Determination of β-galactosidase activity in culture medium of Staphylococcus aureus

3 结论

本实验通过不同提取方式来获取高地芽胞杆菌CQC1发酵液中肽类抗菌物质，结果发现，硫酸铵饱和沉淀法和正丁醇提取物均能提取肽类抗菌物质，且正丁醇提取物活性强于硫酸铵饱和沉淀物，氯仿相没有显示出抗菌活性，表明发酵液中抗菌肽提取物活性成分极性可能比较大，易溶于正丁醇，且正丁醇在一定程度上起到提取和浓缩的作用。因此，选取正丁醇相抗菌肽提取物进行稳定性和抗菌机制的研究，结果表明，正丁醇相抗菌肽提取物经不同pH、温度和水解酶处理后，抗菌活性之间相比差异有统计学意义，经121℃处理30 min 活性仅降低了14.3%；pH 11.0 处理后，抑菌活性下降了9.5%；通过大分子释放量和β-半乳糖苷酶活性测定结果表明，高地芽胞杆菌CQC1产抗菌肽可以改变金黄色葡萄球菌细胞膜的通透性，引起膜内物质泄漏到胞外，从而产生抗菌活性。