李宇航 王兴平 杨箭 罗仍卓么 任倩倩 魏大为 马云

（1. 宁夏大学农学院，银川 750021；2. 宁夏回族自治区反刍动物分子细胞育种重点实验室，银川 750021）

奶牛乳腺炎发病率很高，是奶牛最常见的疾病之一，难以根除，对牧场的经济效益造成了巨大影响［1］。引起乳腺炎的原因复杂，主要与遗传、病原微生物感染和饲养管理等多个因素有关［2］，其中遗传因素与乳腺炎的易感性和抗病性密切相关。研究表明，奶牛乳腺炎的发生和发展过程受多个基因调节［3-4］，其分子调控机制尚未完全阐明。

microRNA（miRNA）是一类广泛存在于真核细胞中的内源性非编码小RNA，长度约20-25个核苷酸，可通过靶向mRNA的3'UTR来调节mRNA的转录和翻译，从而参与调节多种生理及病理过程的发生和发展［5］。研究发现，miRNA是涉及炎症、癌症等多种疾病的重要调控因子［6-7］。就奶牛乳腺炎而言，学者们筛选了大量的乳腺炎差异表达miRNA［8-11］，但是仅有少数的miRNA进行了功能研究。如miR-146a可通过下调Toll样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）/肿瘤坏死因子受体相关因子6（tumor necrosis factor receptor related factor 6，TRAF6）/核转位因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路减轻奶牛乳腺炎症［12］，miR-23a通过靶向磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositide 3 kinases，PI3K）抑制乳腺炎症反应［13］，仍有大量的差异表达miRNA有待于进一步探索。

MiR-665是miRNA家族成员之一。在人类的炎症性疾病中，miR-665在结肠炎中显著上调，通过抑制X盒结合蛋白1（X-box binding protein-1，XBP1）和血清类黏蛋白1样蛋白质3（Orosomucoid 1-like 3，ORMDL3）而诱导细胞凋亡和结肠炎［14］。miR-665通过靶向髓样细胞触发受体2（triggering receptor expressed on myeloid cells 2，TREM2）基因抑制人脊髓损伤后的炎症反应［15］。在小鼠中，miR-665在真菌引起的角膜炎中表达上调，通过靶向自噬相关基因5（autophagy-related gene 5，ATG5）加重角膜炎症［16］。在奶牛乳腺炎中，前期通过乳腺组织的转录组测序分析，发现miR-665在大肠杆菌（E. coli）型乳腺炎奶牛的乳腺组织中的表达显著上调［8］，但是，miR-665在奶牛乳腺炎中的分子作用机制尚不清楚。因此，本实验研究了miR-665在奶牛乳腺炎上皮细胞炎症反应中的表达水平和调控作用，以期为奶牛乳腺炎的分子调控机制解析和分子育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究以实验室冻存的、经鉴定的奶牛乳腺上皮细胞作为实验材料。

PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser逆转录试剂盒和Trizol试剂购自宝日医生物技术（北京）有限公司，2×M5 HiPer SYBR Premix EsTaq（withTli RNaseH）荧光定量检测试剂盒购自北京聚合美生物科技有限公司，胰酶消化液、DMEM/F12培养基和PBS缓冲液购自Hyclone公司（美国），胎牛血清购自BI公司（以色列），LPS购自Sigma-Aldrich公司（美国），引物由通用生物系统（安徽）有限公司 合成。

厉新建（1973— ），男，浙江东阳人，博士，北京第二外国语学院教授，研究方向：旅游经济发展战略、旅游企业跨国（境）经营等。通讯作者。

1.2 方法

1.2.1 乳腺上皮细胞的培养及炎症诱导 将乳腺上皮细胞解冻后，采用10%胎牛血清的DFEM/F12培养基，在37℃、5% CO2浓度和100%饱和湿度的条件下，接种培养于6孔细胞培养板中。待细胞融合至60%-70%时，利用50 ng/μL LPS诱导细 胞［17-18］，分别在诱导的0（未处理对照组）、3、6和12 h收集细胞，用于RNA提取。通过细胞炎症因子的qPCR检测确定炎症诱导是否成功。

通过不同时期的三颜色通道分布图可以看出该菌体不同生长时期浑浊度的不同带来的HSV颜色平均值的变化满足一定的曲线变化规律，也符合菌体繁殖生长所经历的的迟缓期，对数期，稳定期三个时期的变化.能给客观的通过颜色特征值的改变的反应培养孔菌体不同生长时期菌体数量的变化，能为菌体生长情况的筛选提供依据.

表1 miR-665的逆转录及qPCR引物Table 1 Reverse transcription and qPCR primers of miR-665

越来越多的研究表明，miRNA是炎症的重要调节因子。在奶牛乳腺炎中许多miRNA已被发现产生不同的作用［12-13，22-23］。同样，miR-665被发现在多种癌症疾病中发挥着重要的作用，但其在不同的癌症中作用不一致，如在人胃癌和卵巢癌中分别靶向蛋白磷酸酶2调节亚基（protein phosphatase 2 regulatory subunit Balpha，PPP2R2A）和同源框基因A10（homeobox A10，HOXA10），起到抑制癌症的作用［24-25］。然而，在乳腺癌中miR-665通过靶向核受体亚家族4A组成员3（nuclear receptor subfamily 4 group A member 3，NR4A3）激活促进人乳腺癌细胞的侵袭和转移［26］。

使用DAVID Bioinformatics Resources 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）数据库对潜在靶基因的分子功能（molecular function，MF）、生物学过程（biological process，BP）、细胞组分（cellular component，CC）进 行gene ontology（GO）功 能注释，并进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，以筛选P＜0.05为阈值，综合确定miR-665的生物学功能。

1.2.4 miR-665潜在关键靶基因的筛选及其在奶牛乳腺上皮细胞炎症反应中的表达检测 根据miR-665的靶基因预测和KEGG及GO功能注释结果，结合细胞炎症相关信号通路上的关键基因，筛选出丝裂原活化蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14）、丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶2（mitogen-activated protein kinase kinase kinase 2，MAP3K2）、SMAD家族成员2（SMAD family member 2，SMAD2）、特 异 性 蛋 白1（specificity protein 1，SP1）共4个炎症相关基因。

布莱德先生说：“当给予适当的条件的时候，人们是很愿意讨论死亡的，特别是当死亡迫在眉睫的时候。刚来的人，大都比较紧张，对死亡不了解，不知道自己将怎样迈向死亡。我们让他接受冥想训练。其核心就是当生命的最后一瞬间，只有你一个人，你将如何走向死亡。这真是一个很有效的训练。当反复训练终于完成之后，病人就不再害怕死亡了。我们把最后的时刻简称为‘在床边’，因为死神是在床边带走我们的。那种时候，往往是你一个人。当然，我们这里是24小时都有人值班的，但我们不能保证你‘在床边’的时候，旁边一定会有人。所以，每个人都要练习独自一个人‘在床边’，在那种时刻，保持最后的平静。”

分别以奶牛乳腺上皮细胞炎症诱导0、3、6和12 h的cDNA为模板，用表2中的引物进行上述4个潜在关键靶基因的qPCR检测，反应体系和反应条件同1.2.2。

表2 miR-665潜在关键靶基因的qPCR引物Table 2 qPCR primers for potential key target genes of miR-665

为探讨miR-665在LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞中的表达情况，采用qPCR技术检测了miR-665在LPS诱导乳腺上皮细胞0、3、6和12 h的表达情况。结果表明，与对照组0 h相比，miR-665在LPS诱导炎症反应的3、6和12h的表达量均极显著上调（P＜0.01）（图2）。

2 结果

2.1 LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞产生炎症反应

为进一步探讨miR-665在乳腺上皮细胞炎症反应中的作用，根据靶基因预测、KEGG通路、GO功能注释，结合主要细胞炎症与机体免疫关键信号通路，初步得到了MAPK14、MAP3K2、SMAD2和SP1共4个基因与炎症和机体免疫密切相关。随后采用qPCR技术检测了上述4个基因在LPS诱导的炎性乳腺上皮细胞中的表达量，结果表明，与对照组（0 h）相比，MAPK14、SMAD2和SP1基因在LPS诱导细胞3、6和12h的表达均极显著下调（P＜0.01），MAP3K2基因在LPS诱导细胞6和12 h的表达极显著下调（P＜0.01）（图7）。值得注意的是，这4个基因与miR-665表达变化呈相反趋势。

图1 主要炎症因子在LPS诱导的乳腺上皮细胞炎症中的表达Fig.1 Expression of major inflammatory factors in the LPSinduced inflammation of mammary epithelial cells

2.2 miR-665在LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞中的表达规律

1.2.5 基因表达量的统计分析 以GAPDH和RPS18为双内参，采用2-ΔΔCt法［19］分析相对表达量计算，以均数±标准差（±s）表示。每个处理进行了3个生物学重复试验。采用SPSS 25.0软件，通过独立样本t检验进行组间的差异表达显著性检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

1）实验组和对照组总体情况比较。实验组实际参与测试的人数为33名；对照组实际参与测试的人数为29名（病假四名）。测试题目有问答题目、听力测试、认读卡片、背诵儿歌，共100分。从表1可以看出，实验组在听说训练等方面的均分均高于测试组。

图2 miR-665在LPS诱导的乳腺上皮细胞中的表达量检测Fig.2 Expression detection of miR-665 in the LPS-induced mammary epithelial cells

2.3 miR-665的基因定位及保守性分析

应用miRBase可知奶牛miR-665位于21号染色体上。另外，对奶牛、人和小鼠等物种的miR-665序列进行分析，发现miR-665在物种间高度保守（图3），说明牛miR-665可能具有与人、小鼠等其他动物相似的功能。

由于拱棚栽培升温快，土壤水分蒸发量大，因此播种时如底墒不足，最好先浇水再播种，浇水时应逐沟、分段进行，注意控制水量和水流速度。

图3 牛与人、小鼠miR-665的序列对比图Fig.3 Sequence comparison of miR-665 from bovine，human and mouse

2.4 miR-665靶基因的预测、GO功能注释及KEGG通路分析

为探讨miR-665的生物学功能，预测了miR-665的靶基因。结果显示，Target Scan在线工具预测出2 127个靶基因，miRWalk预测出1 019个靶基因。二者取交集后共得到了201个潜在靶基因（图4）。

图4 miR-665差异表达的潜在靶基因筛选的韦恩图Fig.4 Venn diagram for screening potential target genes differentially expressed by miR-665

对MAPK14、MAP3K2、SMAD2和SP1基因 进 行保守性分析（表3）。结果表明，牛MAPK14、MAP3K2、SMAD2和SP1与小鼠和人的序列相似性达84.34%-93.96%，具有较高的保守性，说明以上4个基因在牛与小鼠和人之间具有相似的生物学功能。

图5 miR-665潜在靶基因的GO功能注释结果Fig.5 GO functional annotation results of miR-665 potential target genes

图6 miR-665潜在靶基因的KEGG通路分析结果Fig.6 Results of KEGG pathway analysis of miR-665 potential target genes

2.5 miR-665相关基因在奶牛乳腺上皮细胞炎症中的表达分析

为证实炎症诱导是否成功，本研究采用qPCR技术，检测了用LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞中主要炎症因子IL-1β和IL-8的表达量，结果表明，与对照组0 h相比，IL-1β和IL-8在LPS诱导的3 h、6 h和12 h的细胞中的表达水平均显著上调（图1）。上述结果证明，LPS成功诱导了奶牛乳腺上皮细胞产生炎症反应。

图7 miR-665相关基因在奶牛乳腺上皮细胞炎症中的表 达量Fig.7 Expression of miR-665 related genes in the bovine mammary epithelial cell inflammation

2.6 物种间MAPK14、MAP3K2、SMAD2和SP1基因的保守性分析

201个潜在靶基因的GO功能富集发现，这些基因分子功能主要包含泛素蛋白连接酶活性、G蛋白结合、泛素样蛋白连接酶活性，主要富集在突触囊泡膜、胞外囊泡膜、细胞器膜的内在成分、突触小泡、突触囊泡等，生物学过程主要为对脂肪酸的反应、蛋白质去磷酸化负调节、突触囊泡周期调节、去磷酸化负调节等（图5）。KEGG通路分析结果表明，上述基因参与MAPK、心肌细胞的肾上腺素能信号、癌症中的蛋白多糖、黏附连接、白细胞跨内皮迁移、上皮细胞的细菌入侵等炎症反应或机体免疫相关的信号通路（图6）。

“共享单车”首例触犯刑案即是“私藏共享单车”。2016年，上海市闵行区人民法院对首例共享单车刑案做出一审判决，以盗窃罪判处犯罪人韩某某拘役三个月，缓刑三个月，并处罚金一千元。本案的具体案情为：五十二岁的韩某某因见门口的共享单车几日无人使用，便想自己占有一辆，于是趁无人注意时，将车直接搬入自己家中，但因无法开锁，便搁置家中。

表3 牛与人、小鼠相关基因的同源性分析结果Table 3 Homology analysis of related genes in the bovine，human and mouse

3 讨论

奶牛乳腺炎是乳腺组织产生的炎症反应，可导致牛奶的产量和质量下降［20］。在缺乏有效治疗的情况下，使牛奶繁殖力下降，利用年限减少，对牧场造成极大的经济损失［21］。E. coli是引起奶牛临床型乳腺炎最常见的病原微生物之一。LPS是E. coli外膜的主要成分，能够促使IL-1β和IL-8等炎症细胞因子分泌，启动炎症反应和机体免疫［20］。乳腺上皮细胞是识别病原体入侵的第一道防线，是奶牛乳腺免疫系统的重要组成部分，在LPS诱导后，常常作为乳腺炎研究的细胞模型［12］。

1.2.2 细胞RNA提取、主要炎症因子mRNA及miR-665的RT-qPCR检测 采用TriZol试剂盒，按照产品说明书提取上述经LPS诱导的乳腺上皮细胞的总RNA。用电泳和紫外微量分光光度计检测RNA的浓度与质量。采用Primer Permier 5.0软件设计白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和白介素-8（interleukin-8，IL-8）炎症因子基因和miR-665的颈环逆转录引物（表1），使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser逆转录试剂盒分别进行miR-665，IL-1β和IL-8炎症因子mRNA的cDNA合成。以此cDNA为模板，用2×M5 HiPer SYBR Premix EsTaq（withTli RNaseH）荧光定量检测试剂盒，在伯乐CFX-96荧光定量PCR仪上检测miR-665和相关mRNA在细胞中的表达量。反应体系为：2×M5 HiPer SYBR Premix EsTaq（withTli RNaseH）10 μL，上下游引物各0.8 μL，DNA模板1.0 μL，加灭菌去离子水至20 μL。反应条件为：预变性95℃ 30 s，95℃ 5 s、60℃ 30 s共40个循环，95℃ 10 s，65℃ 5 s。

1.2.3 miR-665的靶基因预测及生物信息学分析 通 过miRBase（http：//www.mirbase.org/）和NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）在 线 工 具 获 得miR-665的序列、染色体定位等基本信息，并利用DNAman软件分析物种进化保守性。使用Target Scan（http：//www.targetscan.org/vert_72/）和miRWalk （http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）两种在线软件预测miR-665的靶基因，再利用VENNY 2.1在线软件（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）取交集，最终确定miR-665的潜在靶基因范围，用于后续分析。

在奶牛乳腺炎的研究中，迄今为止未见miR-665调控作用的研究报道。因此，本研究以LPS诱导的乳腺上皮细胞为炎症模型，发现miR-665在奶牛乳腺上皮细胞炎症反应不同时间的表达量均显著上调，与LPS诱导的奶牛乳腺组织炎症中的测序结果一致［8］，提示miR-665在奶牛乳腺炎中发挥着重要的作用。此外，通过生物信息学分析，发现miR-665可能调节201个潜在靶基因，其中部分靶基因参与的MAPK信号通路、上皮细胞的细菌入侵、Th17细胞分化、肿瘤坏死因子信号通路、PPAR信号通路、ErbB信号通路等与炎症的发生、发展，细胞的周期和凋亡等具有密切关系［27-30］。

这样的生活化操作方式有效激发了学生的学习热情，在学生剪纸完成后教师再加以适当的问题引导。比如说计算学生这次剪纸过程中所用去的剪纸总量，然后学生便会运用到本课分数加减法的知识点列出算式1/9+1/9+2/9+1/9等于5/9。然后让学生利用分数减法对剪纸剩余部分进行分数计算，学生便会列出1-5/9等于4/9这样的分数算式。通过这样的实践操作能力，使学生通过实践获得对知识的深层次理解，学生在操作过程中便能进行对数学问题的构建，加强对知识的深入思考。在进行计算时学生有效地通过实践获得准确的算式组合，从而得到正确的探究结论。

值得注意的是，通过生物信息学和qPCR联合分析发现，miR-665可能靶向或间接调控4个基因，分别为MAPK14、MAP3K2、SMAD2和SP1。其中，MAPK14是MAPK蛋白激酶的成员，在炎症、癌症及自身免疫中起着关键作用［31］。它可以被趋化因子、氧化应激、白介素-1（interleukin-1，IL-1）、细菌LPS和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等多种因子激活［31］。LPS诱导的急性肺损伤小鼠肺组织中，抑制MAPK14能阻断MAPK信号通路，阻断促炎细胞因子的上调，从而减轻LPS诱导的小鼠急性肺损伤［32］。在LPS诱导的人心肌细胞炎症反应中，上调MAPK14的表达，能够加重心肌炎症和心肌损伤［33］。同样，MAP3K2也是MAPK信号通路中的上游基因，在炎症中发挥着促进作用［34］。如在大鼠的心肌梗死中，MAP3K2能够促进炎症和细胞凋亡，加重心肌损伤［35］。Wu等［36］发现MAP3K2能够通过肠内的辅助性T细胞1（T helper cell 1，Th1）的介导而加重小鼠结肠炎；反之，阻断T细胞特异性IL-18R-MAP3K2信号通路可以通过抑制Th1细胞的增殖来减轻小鼠肠道炎症。本研究中，MAPK14和MAP3K2在乳腺上皮细胞炎症中的表达量显著下调，与miR-665的表达呈负相关，发现miR-665、MAPK14和MAP3K2在物种间的高度保守，推测miR-665可能通过抑制MAPK14与MAP3K2基因的表达而缓解乳腺上皮细胞的炎症并抑制乳腺上皮细胞的凋亡。此外，我们还发现MAP3K2在LPS诱导3 h的乳腺上皮细胞中表达极显著上调，推测MAP3K2的表达量升高可能是LPS刺激细胞初期的应激反应，而在后期表达量降低，进而发挥对细胞炎症的调节作用。

SMAD2是转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF-β）信号通路中的下游分子，能够调节细胞的增殖、分化、凋亡及自噬等多种生物学过程，在炎症的不同时期发挥着重要的作用［37-38］。研究表明，在大鼠肝损伤模型中，激活TGF-β1/Smad2信号通路可促进败血症性肝损伤的发生［39］。在炎症引起的肺纤维化中，抑制基质金属蛋白酶9（matrix metallopeptidase 9，MMP-9）和TGF-β/Smad2/3通路的激活能够阻断EMT的发生［40］。此外，Smad2和Smad3在肾脏疾病中被激活，通过TGF-β/Smad和NF-κB的激活加剧肾纤维化和炎症［41］。Qin等［42］发现SMAD2基因的敲除对肾毒性和缺血性急性肾损伤小鼠模型的肾损伤、程序化细胞死亡和肾炎症均有保护作用。因此，推测miR-665可能通过负调节SMAD2进而减轻奶牛乳腺炎症。

SP1在乳腺癌、胃癌和肺癌等多种癌症中过度表达［43-45］，调节肿瘤细胞的增殖及凋亡。在炎症中SP1也发挥着重要的作用。Wang等［46］发现miR-29c可能通过直接靶向SP1而减轻帕金森病的炎症反应。此外，通过抑制SP1和NF-κB信号通路的基因治疗可能为调控脂质代谢及动脉粥样硬化相关炎症性疾病提供了一个新的靶点［47-48］，表明在奶牛乳腺上皮细胞炎症中，miR-665也可能靶向SP1发挥抑炎作用。

综上所述，miR-665在炎性乳腺上皮细胞中的表达量显著上调，与潜在靶基因的MAPK14、MAP3K2、SMAD2和SP1的表达量呈相反趋势，说明miR-665可能靶向或间接调控MAPK14、MAP3K2、SMAD2和SP1基因而缓解乳腺上皮细胞的炎症反应并抑制乳腺上皮细胞的凋亡。

4 结论

奶牛miR-665在LPS诱导炎症的奶牛乳腺上皮细胞中的表达上调，与潜在靶基因MAPK14、MAP3K2、SMAD2和SP1的表达量呈显著相反趋势；上述基因在牛、人和小鼠中高度保守。miR-665可能靶向或间接调控MAPK14、MAP3K2、SMAD2和SP1基因而抑制LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞凋亡和炎症反应。