甘露醇原料药及其制剂中甘露醇的高效液相色谱-电喷雾检测器分析方法*

2022-06-10赵慧王董云吴珺

中国药业 2022年11期

赵慧，王董云，吴珺

（江苏省泰州市药品检验院，江苏泰州 225300）

甘露醇（D-甘露糖醇）为良好的脱水利尿药，临床常用于降眼压、降颅内压等，也常用于治疗急性肾功能衰竭的尿闭症。甘露醇也为常用药用辅料，可用作药物制剂的赋形剂，固体、液体的稀释剂，以及冻干粉针剂的载体［1］。2020年版《中国药典（二部）》中采用高效液相色谱（HPLC）法测定其有关物质，但灵敏度低、柱温高、适用性差等；采用容量分析法测定甘露醇含量，操作烦琐，专属性差［2］。目前，甘露醇及其制剂中甘露醇的研究方法主要有HPLC法、离子色谱法、旋光法、紫外-可见分光光度法等［3-5］，其中应用较广的是HPLC法，大多采用蒸发光散射检测器（ELSD）或示差检测器（RID）进行测定［6-7］。ELSD大多采用氨基柱，存在柱效下降快、灵敏度低等问题；RID大多采用离子交换柱，存在柱温高、适用性差、基线波动大等问题。电喷雾检测器（CAD）是一种新型通用检测器，具有灵敏度高、重复性好等优势，且检测信号响应不依赖于被测物的化学结构，适用于不挥发性或半挥发性物质的检测，被广泛应用于皂苷类、糖类、生物碱类、脂类化合物等无紫外吸收或弱紫外吸收组分的测定［8］。本研究中采用HPLC-CAD法对甘露醇原料药及其制剂中的甘露醇进行分析，具有简便、快速、灵敏、准确等优势。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UltiMate 3000型高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司），配有UltiMate 3000型四元泵、UltiMate 3000型自动进样器、Corona Veo RS型电喷雾检测器、ChromeleonTM色谱工作站；KH-400KDE型高功率数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司，功率为400 W，频率为40 kHz）；Mettler XSE205DU型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度为十万分之一）。

1.2 试药

甘露醇对照品（中国食品药品检定研究院，批号为100533-201304，含量为99.0%）；乙腈（色谱纯，西班牙Scharlau公司）；盐酸、氢氧化钠、30%过氧化氢（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；试验用水均由Milli-Q纯水系统制备；甘露醇原料药3批；注射用胸腺五肽为胸腺五肽加适量甘露醇经冷冻、干燥制成的无菌冻干品，共3批，拟采用注射用胸腺五肽进行制剂中甘露醇的测定。各样品批号和来源见表1。

表1 样品批号和来源Tab.1 Batch numbers and sources of samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters XBridge Amide柱（250 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流动相：乙腈-水（70∶30，V/V）；流速：1 mL/min；柱温：35℃；进样量：10 μL；电喷雾检测器参数：雾化温度为55℃，幂率为1.0，采样频率为10 Hz，过滤常数为3.6 s。

2.2 溶液制备

取甘露醇对照品10 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，加水溶解并定容，摇匀，作为对照品溶液。取甘露醇样品10 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，加水溶解并定容，摇匀，作为甘露醇供试品溶液。取注射用胸腺五肽内容物适量，精密称定，加水适量，超声使溶解，用水稀释成每1 mL约含0.1 mg甘露醇的注射用胸腺五肽供试品溶液。取甘露醇样品约50 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加水溶解并定容，摇匀，作为有关物质测定用供试品溶液；精密量取1 mL，置100 mL容量瓶中，用水稀释并定容，摇匀，作为有关物质测定用对照品溶液。以水作为空白溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：精密吸取空白溶液，2.2项下甘露醇对照品溶液、甘露醇供试品溶液及注射用胸腺五肽供试品溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，按2.1项下色谱条件进样测定，色谱图见图1。结果表明，空白溶剂对主峰无干扰，样品中杂质对测定无干扰，甘露醇色谱峰理论板数大于5 000，拖尾因子小于1.2。

1.甘露醇A.注射用胸腺五肽供试品溶液B.空白溶液C.甘露醇供试品溶液D.甘露醇对照品溶液图1 专属性试验高效液相色谱图1.MannitolA.Test solution of Thymopentin for Injection B.Blank solution C.Test solution of mannitol D.Reference solution of mannitolFig.1 HPLC chromatograms of the specificity test

破坏性试验：取甘露醇对照品10 mg，精密称定，分别置10 mL容量瓶中，加水适量使溶解，分别进行以下破坏性试验。1）碱破坏。加入0.1 mol/mL氢氧化钠溶液1 mL，室温放置4 h，加入0.1 mol/mL盐酸溶液1 mL，用水稀释至刻度，摇匀。2）酸破坏。加入0.1 mol/mL盐酸溶液1 mL，室温放置4 h，加入0.1 mol/mL氢氧化钠溶液1 mL，用水稀释至刻度，摇匀。3）氧化破坏。加入30%过氧化氢溶液1 mL，室温放置4 h，用水稀释至刻度，摇匀。4）高温破坏。水浴加热4 h，放冷至室温，用水稀释至刻度，摇匀。精密量取上述破坏后的试验溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，按2.1项下色谱条件进样测定，色谱图见图2。结果各破坏性试验产生的杂质峰均能与甘露醇主峰达到有效分离，对测定无干扰，表明方法专属性良好。

线性关系考察：取甘露醇对照品20 mg，精密称定，置20 mL容量瓶中，加水溶解并定容，摇匀，作为对照品贮备液；精密量取适量，用水分别稀释成质量浓度为10，20，50，100，200 μg/mL的系列对照品溶液。精密量取上述溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，按2.1项下色谱条件进样测定。以甘露醇的峰面积（Y）为纵坐标、对照品溶液质量浓度（X）为横坐标进行线性回归，得回归方程Y=1.967 5X+25.487 0（r=0.997 8，n=5）。结果表明，甘露醇质量浓度在10～200 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

1.甘露醇A.高温破坏B.氧化破坏C.碱破坏D.酸破坏图2 破坏性试验高效液相色谱图1.MannitolA.High-temperature damage B.Oxidative damage C.Alkali damage D.Acid damageFig.2 HPLC chromatograms of damage tests

定量限和检测限确定：取甘露醇对照品适量，精密称定，加水溶解并稀释成系列质量浓度的溶液，并进样测定，以信噪比（S/N）为3时的质量浓度为检测限，以S/N为10时的质量浓度为定量限。结果检测限为0.2 μg/mL，定量限为1.0 μg/mL。

精密度试验：精密吸取质量浓度为0.1 mg/mL的甘露醇对照品溶液适量，按2.1项下色谱条件连续进样测定。结果甘露醇色谱峰保留时间和峰面积的RSD分别为0.07%和0.24%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取甘露醇原料药（批号为FL2005003）及注射用胸腺五肽（批号为19042721）各6份，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，按外标法计算。结果甘露醇及注射用胸腺五肽中甘露醇含量分别为99.21%和0.93 mg/mg，RSD分别为0.34%和0.54%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取2.2项下甘露醇供试品溶液适量，分别于0，4，8，12 h时按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果甘露醇色谱峰峰面积的RSD为1.20%（n=4），表明甘露醇供试品溶液在常温下12 h内稳定。

耐用性试验：通过调节流动相比例、流速及柱温，考察甘露醇主峰的拖尾因子及与相邻杂质峰的分离情况。结果甘露醇峰的拖尾因子均小于1.2，杂质对主峰无干扰，表明方法耐用性良好。

加样回收试验：取已知甘露醇含量的注射用胸腺五肽（批号为19042721）9份，精密称定，每组3份，分别按比例精密加入相当于甘露醇含量80%，100%，120%的甘露醇对照品，加水溶解，分别制成高、中、低3个浓度的供试品溶液，平行3次。按2.1项下色谱条件各进样测定，计算加样回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test（n=9）

2.4 样品含量测定

分别取甘露醇原料药（批号分别为FL2005003，E790G，361512014），注射用胸腺五肽（批号分别为19082321，19042721，18092521）和甘露醇对照品（批号为100533-201304）各适量，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液与对照品溶液，平行2份，每份按2.1项下色谱条件进样测定2次，记录峰面积，按外标法计算含量。结果见表3。

表3 甘露醇含量测定结果（n=4）Tab.3 Results of content determinationin of mannitol（n=4）

2.5 有关物质测定

取甘露醇原料药（批号分别为FL2005003，E970G，361512014）适量，依法制备有关物质测定用供试品溶液和对照品溶液，分别注入液相色谱仪，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图至甘露醇主峰保留时间的3倍，按自身对照法计算杂质的含量。结果见表4。

表4 甘露醇原料药中有关物质测定结果（%）Tab.4 Results of determinationin of related substances in mannitol API（%）

3 讨论

3.1 色谱条件选择

常采用氨基柱或强阳离子交换柱对甘露醇进行检测，但氨基柱柱效下降快，强阳离子交换柱使用柱温高、适用性差。本研究中采用XBridge Amide色谱柱，该色谱柱采用了化学稳定、三键键合式的酰胺官能团，为杂化硅胶基质的新型亲水色谱柱，适合分析极性化合物，且稳定性更高，使用寿命更长［9-11］。本研究中分别考察了不同流动相比例对测定结果的影响，结果随着水相比例的增加，甘露醇色谱峰的保留时间不断缩短，理论板数也不断增加。综合考虑分离效果、检测灵敏度及分析时间，最终选择乙腈-水（70∶30，V/V）为流动相。

3.2 CAD参数选择

本研究中分别考察了35℃和55℃两档雾化器温度对检测结果的影响，结果发现，样品检测灵敏度会随着雾化温度的增加而升高，故选择55℃作为雾化器温度。幂率是CAD检测器特有的线性校正参数，不同的化合物具有不同的最优幂率。本研究中分别考察了不同的幂率（0.9，1.0，1.1）对甘露醇线性关系的影响，结果发现，随着幂率的增大，其线性回归的相关系数也不断增大，但甘露醇色谱峰的响应也在不断下降。综合考虑线性关系和响应的影响，幂率最终选定1.0。