田沛霖，李玥琦，王思渊，鲁辉，张国林

（江苏省苏州市药品检验检测研究中心，江苏 苏州 215104）

程序性死亡蛋白-1（PD-1）抑制剂是目前唯一在中国应用的免疫抑制剂［1］。其通过PD-1免疫检查点对T淋巴细胞活化和增殖的抑制作用，恢复T淋巴细胞的活性和个体免疫系统杀伤肿瘤细胞的能力［2］。目前，PD-1抑制剂治疗肝癌、胃癌、黑色素瘤、鼻咽癌、非小细胞肺癌等多种实体瘤的效果良好［3-5］，应用前景广阔。现已上市的PD-1抑制剂产品多为注射液或冻干粉针剂，往往会加入甘露醇以提高制剂稳定性，防止多肽或蛋白相互聚集，调整缓释制剂产品降解速率等［6］。甘露醇为六元糖醇，测定方法包括氧化还原滴定法［7-8］、分光光度法［9-10］、高效液相色谱法［11］、气相色谱-质谱联用法［12］、离子色谱法［13］等。其中，高效液相色谱-示差折光检测器（HPLC-RID）法是目前最常用的方法，已收载于历版《中国药典》，普遍用于各PD-1抑制剂产品现行质量标准。但RID受温度及流动相组成等外界因素干扰较大［14］，不适合梯度洗脱，且存在灵敏度较低、信号欠稳定等不足［15］，在样品浓度较低时重复性较差。电喷雾检测器（CAD）为新型检测器，近年来发展迅速，2020年版《中国药典（四部）》通则0512 HPLC法中首次增加了对该检测器的相关介绍［16］。其检测原理是将洗脱液雾化后形成颗粒，经蒸发管干燥后与带电氮气碰撞，使分析物颗粒表面带正电荷，通过静电计测量分析物颗粒表面的电荷量，使分析物颗粒的质量色谱峰面积与表面所带电荷量相关，成为确定物质浓度的依据［17］。本研究中建立了快速、准确测定PD-1抑制剂特瑞普利单抗注射液中甘露醇含量的HPLC-CAD法，为完善该类制剂的质量标准提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UltiMate 3000型高效液相色谱仪（美国赛默飞世尔科技有限公司），包括Corona Veo RS型CAD、变色龙工作站；XSE205DU型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司，精度为0.01 mg/0.1 mg）；Millipore Synergy型超纯水机（美国密理博公司）。

1.2 试药

特瑞普利单抗注射液（国内某企业，批号分别为201908030，201909032，201909034，规 格 均 为 每 瓶240 mg∶6 mL）；甘露醇对照品（中国食品药品检定研究院，批号为100533-202006，纯度为99.5%）；乙腈（色谱纯，霍尼韦尔公司，批号为V3OA1H）；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Supelco apHera NH2氨基分析柱（150 mm×2 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水溶液（80∶20，V/V）；流速：1.0 mL/min；进样室温度：5℃；柱温：40℃；进样量：3 μL；雾化气：氮气（纯度超过99.0%），雾化室温度：50℃；幂率：1.0；采样频率：10 Hz；过滤常数：5.0 s。

2.2 溶液制备

取甘露醇对照品50 mg，精密称定，置25 mL容量瓶中，加超纯水溶解并定容，制成质量浓度为2.0 mg/mL的对照品贮备液。分别精密量取适量上述溶液，置10 mL容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，制成质量浓度分别为0.125，0.250，0.500，0.800，1.000 mg/mL的溶液，作为标准曲线溶液。精密量取样品1 mL，用超纯水稀释50倍，即得供试品溶液。取超纯水，作为空白溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：取2.2项下空白溶液、对照品贮备液、供试品溶液各适量，按2.1项下色谱条件分别进样测定。色谱图见图1。可见，空白溶液色谱无干扰；对照品贮备液和供试品溶液色谱中，甘露醇色谱峰理论板数均大于1 000，拖尾因子均小于1.0，表明方法专属性良好。

线性关系考察：CAD的响应值与被检测物质的量通常呈指数关系，但在小质量范围内可基本呈线性关系［16］。按2.2项下方法配制对照品标准曲线溶液（取甘露醇对照品51.42 mg，精密称定），分别精密吸取上述溶液各3 μL，按2.1项下色谱条件进样测定，以甘露醇质量浓度为横坐标（X，mg/mL）、峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得回归方程Y=9.336 6X+1.177 0（r=0.997 3，n=5）。结果表明，甘露醇质量浓度在0.125～1.000 mg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

定量限和检测限确定：取2.2项下质量浓度为0.5 mg/mL的标准曲线溶液，逐级稀释并进样测定。当信噪比（S/N）约为10∶1时，得到甘露醇的定量限为0.625 μg/mL；当S/N约为3∶1时，得到甘露醇的检测限为0.200 μg/mL。

精密度试验：取2.2项下质量浓度为0.5 mg/mL的标准曲线溶液，按2.1项下色谱条件重复进样测定6次。结果峰面积的RSD为0.49%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.2项下质量浓度为0.5 mg/mL的标准曲线溶液，按2.1项下色谱条件分别于0，4，8，12，16，20，24 h时进样测定。测得甘露醇峰面积的RSD为0.23%（n=7），表明甘露醇溶液在24 h内稳定性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品适量，共6份，依法制备供试品溶液，分别精密加入甘露醇对照品10 mg，按2.1项下色谱条件进样测定，并计算回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

1.甘露醇A.空白溶液B.对照品贮备液C.供试品溶液图1 高效液相色谱图1.MannitolA.Blank solution B.Reference stock solution C.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

2.4 样品含量测定及方法比较

取3批样品，分别按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件分别进样测定，记录色谱峰峰面积，以标准曲线计算甘露醇含量。同时，按企业现行质量标准的方法，采用HPLC-RID法对产品中甘露醇的含量进行测定。结果2种方法甘露醇含量均在企业现行质量标准规定限度范围，且3批样品含量测定结果的相对偏差（RD）分别为0.99%，0.24%，1.10%，表明2种方法均能较好地测定样品中的甘露醇含量。详见表2。

表2 HPLC-CAD法和HPLC-RID法测定PD-1抑制剂中甘露醇含量测定结果Tab.2 Results of content determination of mannitol in the PD-1 inhibitor by the HPLC-CAD and HPLC-RID methods

3 讨论

3.1 HPLC-CAD色谱条件参数选择

过滤常数：取同一份质量浓度为0.5 mg/mL的甘露醇对照品溶液，分别在过滤常数为0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，3.6，5.0，10.0 s且其余色谱条件不变的情况下依次进样。当过滤常数小于2.0 s时，色谱峰峰形存在明显分叉；当过滤常数为10.0 s时，峰高最低。综合考虑，最终选择过滤常数为5.0 s。

进样量：取同一份质量浓度为0.5 mg/mL的甘露醇对照品溶液，进样量分别为20，10，5，3 μL。当进样量大于10 μL时，色谱峰出现过载；当进样量为5 μL时，所得标准曲线的线性关系一般（r＜0.99）。故最终选择进样量为3 μL。

3.2 与现行质量标准检测结果比较

由表2可知，2种检测方法测定甘露醇含量的差异不显著。但现行HPLC-RID法测得结果，2份平行样品之间RD较大，且出峰时间需要约20 min；采用HPLC-CAD法时样品RD更小，约1.5 min即可出峰，说明该方法重复性良好，且更加快速、高效。同时，HPLC-CAD法样品进样只需3 μL，而现行方法为20 μL。对于生产成本较高的生物制品来说，HPLC-CAD法检测时所需样品量更少，可在保证检测结果准确的前提下，有效节约成本。此外，采用HPLC-CAD法检测时，定量限和检测限均明显低于HPLC-RID法，仪器具有更高的响应值和灵敏度。故经综合评估，HPLC-CAD法测定甘露醇具有独特优势。

3.3 方法评价

目前，我国的生物大分子药物正处于蓬勃发展阶段，其质量控制标准有待进一步完善。以PD-1抑制剂中甘露醇含量测定为例，现行质量标准中多以HPLC-RID法进行检测，但该方法对环境敏感，灵敏度较差，无法进行梯度洗脱，且在低浓度检测时重复性较差。CAD是新型通用检测器，具有检测范围宽、灵敏度高、重复性好、操作简便等特点［17］。CAD对所有物质均有响应，且其响应值几乎仅与被测物质的量有关，不依赖于化合物的结构与性质，无需进行复杂的衍生操作即可检测大部分非挥发性和半挥发性物质［18］。本研究中建立的测定PD-1抑制剂中甘露醇含量的HPLC-CAD法，与现行质量标准相比，方法操作简便、灵敏度高、出峰时间短、有效可控，可为相关企业对甘露醇的质量控制提供参考。