余万冰， 潘 贝， 崔 璨， 刘雅琳， 崔 瑛

(河南中医药大学， 郑州 450046)

焦虑症(anxiety disorders)即焦虑性神经症，是以广泛和持续性焦虑或反复发作的惊恐不安为主要特征的神经症性障碍[1]。苯二氮卓类药物自20世纪60年代应用以来一直是治疗焦虑症的主要药物，但长期服用会致药物依赖及停药后的戒断效应[2]。中药在治疗焦虑症时显示出不良反应少、安全性高等特点，目前发现较多具有抗焦虑作用的中药，包括五味子、合欢皮、熟地黄、钩藤等[3-7]。

生地黄为玄参科植物地黄RehmanniaglutinosaLibosch.的干燥块根，性寒味苦、甘，归心、肝、肾经，具有清热凉血、养阴生津的作用，主要用于热入营血、热病伤阴等证[8]。根据张景岳“阴虚而躁动者，非熟地之静不足于镇之；阴虚而刚急者，非熟地之甘不足于缓之”的观点，明确熟地黄具有抗焦虑作用，抗焦虑有效部位为熟地黄多糖。生地黄与熟地黄植物来源和药用部位一致，只是炮制方法不同，且生地黄未经高温炮制多糖成分保存更好，因此推测生地黄可能也具有抗焦虑作用。本研究首先探讨生地黄对装置致焦虑模型的影响，在此基础上根据病证结合的科研思路，结合生地黄养阴生津的特点，建立阴虚焦虑模型，探讨生地黄对阴虚证候下焦虑症的影响。本研究通过河南中医药大学实验动物伦理委员会批准(批号DWLL201402012)。

1 材料

1.1 动物

SPF级雄性昆明小鼠，体质量(20±2)g，购于河南省实验动物中心，实验动物许可证号SCXK(豫)2017-0001。分笼饲养于河南中医药大学动物房IVC独立送风隔离笼具内，室温保持(20±2)℃。

1.2 药物

生地黄(批号17090201)，购自河南省张仲景大药房，为玄参科植物地黄(RehmanniaglutinosaLibosch)的干燥块根，经河南中医药大学药学院陈随清教授鉴定为生地黄正品。地西泮片(2.5 mg/片，批号170101)，购自山西亨瑞达制药有限公司。甲状腺片(40 mg/片，批号20160903)，购自上海长城药业有限公司。

1.3 主要试剂及仪器

酶联免疫γ-氨基丁酸(批号201803，gamma aminobutyric acid,GABA)、谷氨酸(批号201803，glutamate,GLU)、5-羟色胺(批号201803，5-hydroxytryptamine,5-HT)试剂盒；三碘甲状腺原氨酸(批号201804，triiodothyronine,T3)、甲状腺素(批号201804，thyroxine,T4)、促甲状腺激素(批号201804，thyroid stimulating hormone,TSH)试剂盒，上海酶联生物科技有限公司。

IVC-Ⅱ型冯氏小鼠独立送风隔离笼具，苏州冯氏实验动物设备有限公司；PM-200型高架十字迷宫装置，成都泰盟科技有限公司；XR-XB113型小鼠明暗箱装置，上海欣软信息科技有限公司；BioTeK Epoch型酶标仪，美国BioTeK Instruments公司；JW-2017HR型高速冷冻离心机，嘉文仪器装备有限公司。

2 方法

2.1 药物制备

生地黄水煎液的制备：取适量生地黄饮片剪碎，分别加8倍量蒸馏水、6倍量蒸馏水煎煮提取2次，每次提取1 h。合并2次滤液，离心后取上清液浓缩，临用稀释。生地黄多糖部位的制备：取适量生地黄饮片剪碎，分别加8倍量蒸馏水、6倍量蒸馏水煎煮提取2次，每次提取4 h。合并2次滤液，离心后取上清液浓缩至0.5 g·mL-1。加乙醇使含醇量达80%，静置24 h后抽滤，沉淀用相当于4倍量药材的95%乙醇洗涤，挥至无醇味，加蒸馏水溶解至相当于原药材0.5 g·mL-1，加氢氧化钠调pH至8～9，再加入无水氯化钙使W/V达7%，搅拌溶解后放置室温，离心后弃沉淀，取上部溶液继续加乙醇使含醇量达80%，静置24 h后抽滤，沉淀冷冻干燥后研成粉末即得，得率为49.82%。临用前加水溶解，配制成高、中、低剂量的生地黄多糖溶液[9]。生地黄非多糖部位的制备：生地黄多糖制备过程中的乙醇部位作为非多糖部位，冷冻干燥后研成粉末得率为22.27%。临用前加水溶解，配制成0.1 g·mL-1的生地黄非多糖溶液。地西泮混悬液的制备：取地西泮片7.5 mg，加入0.5%的CMC-Na溶液30 mL，配制成0.25 mg·mL-1的地西泮混悬液。甲状腺片混悬液制备：取甲状腺片960 mg，加入0.5%的CMC-Na溶液30 mL，配制成32 mg·mL-1的甲状腺片混悬液。

2.2 造模与给药

2.2.1 焦虑小鼠造模与给药 SPF级雄性昆明小鼠140只，适应性喂养3 d后进行旷场实验筛选分组，以运动距离、中央区域滞留时间为指标，剔除行为能力过强、过弱的小鼠，使得每组动物运动能力无显著差异。分为空白对照组、焦虑模型组、阳性对照组、生地黄高、中、低剂量组、生地黄多糖高、中、低剂量组、生地黄非多糖组每组各12只。空白对照组、焦虑模型组每天灌胃蒸馏水，阳性对照组灌胃地西泮混悬液，生地黄高、中、低剂量组分别灌胃高(8 g·kg-1)、中(4 g·kg-1)、低(2 g·kg-1)剂量的生地黄水煎液，生地黄多糖高、中、低剂量组分别灌胃高(2 g·kg-1)、中(1 g·kg-1)、低(0.5 g·kg-1)剂量生地黄多糖水溶液，生地黄非多糖组灌胃生地黄非多糖水溶液(1 g·kg-1)，连续给药5 d，给药体积为0.1 mL·10 g-1。

空白对照组小鼠不制备焦虑模型，焦虑模型组及各给药组小鼠末次给药1 h后进行高架十字迷宫实验(elevated plus-maze,EPM)联合明暗箱实验制备焦虑模型。实验前先将小鼠单独置于一个鼠笼中自由活动5 min，然后将小鼠头朝开臂置于EPM中央，观察并记录小鼠5 min内运动情况、小鼠开臂进入次数百分比(percentage of open arm entry,OE%)，即开臂进入次数/(开臂进入次数+闭臂进入次数)和开臂滞留时间百分比(percentage of open arm retention time,OT%)，即开臂滞留时间/(开臂滞留时间+闭臂滞留时间)。小鼠EPM实验结束后立即进行明暗箱实验，将小鼠放入明箱、背对暗箱，记录10 min内小鼠在明箱和暗箱之间的穿梭次数。以OE%、OT%、穿梭次数观察动物焦虑状态，评价生地黄抗焦虑作用。

2.2.2 阴虚焦虑小鼠造模与给药 SPF级雄性昆明小鼠150只适应性喂养后进行旷场实验筛选，分为空白对照组、焦虑模型组、阴虚焦虑模型组、阳性对照组、生地黄高、中、低剂量组、生地黄多糖高、中、低剂量组、生地黄非多糖组每组各12只。空白对照组小鼠不制备模型，焦虑模型组小鼠末次给药后制备焦虑模型，阴虚焦虑模型组及各给药组制备阴虚焦虑复合模型，即每天早上灌胃320 mg·kg-1的甲状腺片混悬液，连续给药12 d制备阴虚模型；第12天末次给药1 h后进行EPM联合明暗箱实验制备阴虚焦虑复合模型，同时观察生地黄对阴虚焦虑小鼠行为的干预作用，操作及评价指标如2.2.1。

实验第8天下午开始给药，空白对照组、焦虑模型组、阴虚焦虑模型组分别灌胃蒸馏水，生地黄高、中、低剂量组分别灌胃高(8 g·kg-1)、中(4 g·kg-1)、低(2 g·kg-1)剂量的生地黄水煎液，生地黄多糖高、中、低剂量组分别灌胃高(2 g·kg-1)、中(1 g·kg-1)、低(0.5 g·kg-1)剂量的生地黄多糖溶液，生地黄非多糖组灌胃1 g·kg-1的生地黄非多糖溶液，阳性对照组灌胃地西泮混悬液(2.5 mg·kg-1)，连续给药5 d，给药体积为0.1 mL·10 g-1。

2.3 观察指标

2.3.1 一般情况观察 实验期间观察阴虚造模小鼠外观形态，每天称量小鼠体质量，记录小鼠饮食量和饮水量。

2.3.2 各组小鼠脑内神经递质含量测定 各组小鼠行为学测试结束后立即脱颈椎处死，取全脑，万分之一天平精密称重，以脑组织(g)：PBS溶液(mL)=1∶4的比例加入PBS，细胞粉碎机匀浆粉碎，离心后取上清液即得20%的小鼠脑匀浆液，然后立即进行ELISA检测，按试剂盒说明书测定小鼠脑内GABA、GLU、5-HT含量。

2.3.3 阴虚焦虑实验中各组小鼠血清中T3、T4、TSH含量的测定 将阴虚焦虑复合模型实验中各组小鼠摘眼球取血，离心后取血清，ELISA法测定T3、T4、TSH含量，具体步骤参照试剂盒说明书进行。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 生地黄水煎液及其多糖对焦虑小鼠的影响

3.1.1 生地黄及其多糖对装置焦虑小鼠行为学的影响 与焦虑模型组比较，阳性药、生地黄中剂量、多糖中、低剂量能显著增加焦虑小鼠在明暗箱实验中的穿梭次数(P<0.01，P<0.05)；阳性药、多糖中、低剂量能显著增加焦虑小鼠在EPM实验中的OT%(P<0.01)；阳性药、生地黄中剂量、多糖中、低剂量能显著增加焦虑小鼠EPM实验中的OE%(P<0.01，P<0.05)；生地黄非多糖对焦虑小鼠明暗箱实验中的穿梭次数和EPM实验中OT%、OE%均无显著影响(P>0.05)(见表1)。

表1 生地黄及其多糖对装置焦虑小鼠行为学影响比较

3.1.2 生地黄及其多糖对装置焦虑小鼠脑组织中GABA、GLU、5-HT含量的影响 与空白对照组比较，焦虑小鼠脑组织中GABA含量显著降低(P<0.01)，脑组织中GLU、5-HT的含量显著升高(P<0.05)。与焦虑模型组比较，阳性药、生地黄高、中剂量、多糖中、低剂量能显著增加焦虑小鼠脑组织中GABA的含量(P<0.05，P<0.01)；阳性药、多糖高、中剂量能显著降低焦虑小鼠脑组织中GLU的含量(P<0.01，P<0.01)；阳性药、多糖中、低剂量能显著降低焦虑小鼠脑组织中5-HT的含量(P<0.01，P<0.05)；生地黄非多糖对焦虑小鼠脑组织中GABA、GLU、5-HT的含量均无显著影响(P>0.05)(见表2)。

3.2 生地黄及其多糖对阴虚焦虑小鼠的影响

3.2.1 生地黄及其多糖对阴虚焦虑小鼠一般状态的影响 造模期间，与空白对照组比较，阴虚焦虑模型组小鼠躁动不安，不易抓取，大便干燥，体质量增长缓慢，饮食量、饮水量明显增加，甚至出现眼角黏膜溃烂等症状。给药后，小鼠大便通畅，眼角黏膜溃烂症状逐渐好转，饮食量、饮水量逐渐减少。

表2 生地黄及其多糖对焦虑小鼠脑内递质含量的影响

3.2.2 生地黄及其多糖对阴虚焦虑小鼠体质量增长的影响 造模第3天，与焦虑模型组比较，阴虚焦虑模型组小鼠体质量增长缓慢，造模第9天给药(即给药第2天)后，体质量增长逐渐加快。实验第10天(即给药第3天)，与阴虚焦虑模型组比较，生地黄各剂量组、生地黄多糖各剂量组以及生地黄非多糖组小鼠体质量增长均显著加快(P<0.01)(见表3)。

表3 生地黄及其多糖对阴虚焦虑小鼠体质量增长量的影响

3.2.3 生地黄及其多糖对阴虚焦虑小鼠行为学的影响 与焦虑模型组比较，阴虚焦虑模型组小鼠明暗箱实验中的穿梭次数和EPM实验中的OT% 、OE%均显著减少(P<0.05，P<0.01)，提示阴虚证加重了焦虑小鼠的焦虑行为；与阴虚焦虑模型组比较，阳性药、生地黄中、低剂量、多糖中、低剂量能显著增加阴虚焦虑小鼠明暗箱实验中的穿梭次数(P<0.05，P<0.01)；阳性药、生地黄各剂量、多糖高、中剂量能显著增加阴虚焦虑小鼠EPM实验中的OT%(P<0.01)；阳性药、生地黄高、低剂量能显著增加阴虚小鼠EPM实验的OE%(P<0.01)；生地黄非多糖对阴虚焦虑小鼠明暗箱实验中的穿梭次数和EPM实验中的OT%、OE%无显著影响(P>0.05)(见表4)。

表4 生地黄及其多糖对阴虚焦虑小鼠行为学的影响

3.2.4 生地黄及其多糖对阴虚焦虑小鼠脑组织中GABA、GLU、5-HT含量的影响 与空白对照组比较，焦虑模型组小鼠脑组织中GABA的含量显著降低(P<0.05)，脑组织中GLU、5-HT的含量显著升高(P<0.05)；与焦虑模型组比较，阴虚焦虑模型组小鼠脑组织中GABA的含量显著降低(P<0.05)，脑组织中GLU的含量显著升高(P<0.05)。与阴虚焦虑模型组比较，阳性药、生地黄各剂量、多糖各剂量能显著升高阴虚焦虑小鼠脑组织中GABA的含量(P<0.01，P<0.05)；阳性药、生地黄中、低剂量、多糖中剂量能显著降低阴虚焦虑小鼠脑组织中GLU的含量(P<0.05，P<0.01)；阳性药、多糖各剂量能显著降低阴虚焦虑小鼠脑组织中5-HT的含量(P<0.05，P<0.01)；生地黄非多糖对阴虚焦虑小鼠脑组织中GABA、GLU、5-HT的含量均无显著影响(P>0.05)(见表5)。

表5 生地黄及其多糖对阴虚焦虑小鼠脑组织中GABA、GLU、5-HT含量的影响

3.2.5 生地黄及其多糖对阴虚焦虑小鼠血清中T3、T4、TSH含量的影响 与空白对照组比较，焦虑模型组小鼠血清中T3、T4、TSH的含量差异无统计学意义(P>0.05)；与焦虑模型组比较，阴虚焦虑模型组小鼠血清中T3、T4、TSH的含量显著升高(P<0.05)；与阴虚焦虑模型组比较，阳性药、生地黄高、中剂量、多糖高、低剂量、非多糖能显著降低阴虚焦虑小鼠血清中T3的含量(P<0.05，P<0.01)；阳性药、生地黄高、中剂量、多糖低剂量、非多糖能显著降低阴虚焦虑小鼠血清中T4的含量(P<0.05，P<0.01)；多糖高、低剂量、非多糖能显著降低阴虚焦虑小鼠血清中TSH的含量(P<0.05，P<0.01)(见表6)。

表6 生地黄及其多糖对阴虚焦虑小鼠血清中T3、T4、TSH含量的影响

4 讨论

EPM是根据动物对苯二氮卓类药物敏感性建立的，地西泮是苯二氮卓类在临床上最常用的一种抗焦虑药物[10]。前期研究表明，熟地黄抗焦虑的作用机制与地西泮一致，故选择地西泮作为生地黄抗焦虑作用研究的阳性对照药。

EPM装置利用动物探索新事物的本性与畏惧高悬环境的矛盾心理模拟焦虑情绪，既能导致焦虑也能评价动物焦虑状态[11，12]。中医在治疗疾病时常根据证候选择药物，因此本实验除利用经典装置制备焦虑模型外，还根据生地黄养阴生津特点将中医的阴虚证候与焦虑装置结合制备中医证候焦虑复合模型，观察生地黄的抗焦虑作用。

本实验观察到，阴虚焦虑复合模型组小鼠造模后躁动不安，不易抓取，偶有眼角黏膜溃烂症状；小鼠饮食量增加，但体质量增长缓慢，符合中医阴虚证的特点[13]，提示阴虚证造模成功。与焦虑模型组比较，阴虚焦虑复合模型组小鼠明暗箱实验中的穿梭次数和EPM实验中的OE%显著降低，表明阴虚证能够加重焦虑小鼠在EPM实验和明暗箱实验中的焦虑行为，阴虚焦虑复合模型造模成功。

在小鼠装置焦虑模型、阴虚焦虑复合模型上观察到，生地黄及其多糖能够显著增加焦虑小鼠与阴虚焦虑小鼠明暗箱穿梭次数、OT%和OE%，非多糖组小鼠在明暗箱实验中的穿梭次数和EPM实验中的OT%、OE%较焦虑模型组无显著改变，表明生地黄水煎液及其多糖具有抗焦虑作用。

通过ELISA法测定装置焦虑小鼠与阴虚焦虑小鼠的脑内神经递质含量，发现生地黄水煎液及其多糖能够显著升高焦虑小鼠与阴虚焦虑小鼠脑内GABA含量，降低GLU含量。GABA是脑内一种重要的抑制性神经递质，而GLU为兴奋性神经递质，二者均可导致焦虑。GABA在脑内含量降低引起过强的神经活动，GLU大量释放并堆积于突触间隙则会使谷氨酸受体过度兴奋[14-16]，生地黄水煎液及多糖能够升高GABA含量，降低GLU含量，维持二者的平衡以发挥抗焦虑作用。

在阴虚焦虑复合模型上观察到，生地黄水煎液及其多糖、非多糖部位能使阴虚焦虑小鼠血清中T3、T4含量显著降低，生地黄多糖还能显著降低TSH含量。T3、T4、TSH常作为衡量阴虚证的指标[17]，相关报道显示，焦虑状态也会对下丘脑-垂体-甲状腺轴(hypothalamus-pituitary-thyroid gland，HPT)产生影响，主要表现在脑脊液中促甲状腺激素释放浓度的变化，促甲状腺抗体浓度升高以及TSH的变化[18]。TSH由下垂体前叶分泌，能促进甲状腺合成和分泌T3、T4，而T3、T4含量改变对TSH的生成起负反馈调节作用，以维持机体内三者水平的相对恒定。一般情况下，当血液中游离的T3、T4含量增加会导致TSH含量降低，而本实验中阴虚焦虑复合模型组小鼠血清中T3、T4含量增加的同时TSH的含量也有所增加，可能与HPT轴功能亢进抑制T3、T4对垂体的负反馈调节有关[19，20]。

综上所述，生地黄有明确的抗焦虑作用。其抗焦虑作用机制可能与升高焦虑小鼠及阴虚焦虑小鼠脑组织中GABA的含量，降低GLU、5-HT的含量，减少阴虚焦虑小鼠血清中TSH的含量，从而减少阴虚焦虑小鼠T3、T4的合成和分泌，抑制HPT轴功能亢进有关。生地黄非多糖部位对焦虑小鼠及阴虚焦虑小鼠脑组织中GABA、GLU、5-HT的含量无显著影响，但能显著降低T3、T4、TSH含量，不能排除非多糖部位抗焦虑以外(如纠正阴虚状态)的药效，还需进一步研究加以确定。