刘 佳，李诒光，2，陈 杰*

(1.江西中医药大学，江西 南昌 330004；2.江中药业股份有限公司，江西 南昌 330077)

痛风是一种较为常见的由于体内的嘌呤代谢紊乱，引起的血清尿酸水平升高的慢性疾病。临床多表现为急性关节炎、高尿酸血症等[1-2]。越来越多的研究表明痛风患者体内代谢异常，会导致肥胖、高脂血症、高血压、糖尿病、脑血管等疾病[3]。目前，临床治疗痛风的药物主要有秋水仙碱、非甾体抗炎药、促尿酸排泄药、抑制尿酸生成药等[4]。但长期服用会产生严重的副作用，包括胃肠道反应、肝肾毒性等[5-6]。中草药因具有成本低、安全性高、副作用小的优势，已成为治疗痛风的研究热点。

栀子为茜草科植物栀子GardeniaFructusEllis的干燥成熟果实，性寒味苦，有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒的功效[7]。栀子化学成分主要有环烯醚萜苷类、二萜类、三萜类、黄酮等，具有抗炎[8]、镇痛[9]、降压[10]、抗氧化[11]等药理作用。研究表明，栀子对痛风具有一定的治疗作用[12]，但其发挥药效的物质和作用机制尚不明确。因此，通过网络药理学的方法探讨栀子抗痛风的作用机制，为进一步深入挖掘栀子治抗痛风机制提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 栀子活性成分收集

在TCMSP(https：//tcmspw.com/tcmsp.php)数据库中检索栀子中的化学成分，利用口服生物利用度(OB)≥30%[13]、药物相似性(DL)≥0.18[14]及细胞渗透性(Caco-2)≥-0.4[15]作为筛选条件，筛选出高度活性的有效成分。

1.2 成分作用靶点的获取

在TCMSP数据库中收集栀子的有效成分对应的靶点，导入Uniport数据库，查找对应的靶基因的名称。从ChemSpiders(http：//www.chemspider.com/)数据库中查找栀子有效成分的化学结构并以mol形式保存。导入Swiss ADME(http：//www.swissadme.ch/)数据库，得到有效成分的SMILES结构，再将SMILES结构分别导入Swiss Target Prediction[16](http：//www.swisstargetprediction.ch/)和Similarity Ensemble Approach(https：//sea.bkslab.org/)平台数据库，预测栀子有效成分对应的人潜在靶点。最后，将合并靶点信息并删除重复项，获得药物作用靶点。

1.3 痛风相关靶基因的收集

将关键词“GOUT”，输入OMIM(https：//omim.org/)、DisGENT(https：//www.disgenet.org/)、Genecards(https：//www.genecards.org/)等数据库检索与痛风相关的作用靶点，将所得靶点去除重复项后得到痛风相关靶点。

1.4 构建“药物-活性成分-共同靶点-疾病”网络

分别将栀子活性成分的相关靶点与疾病相关靶点，输入Venny 2.1.0绘制Venny图，筛选两者的共有基因，作为栀子活性化合物治疗痛风的潜在作用靶点。利用Cytoscape 3.7.2软件建立“药物-活性成分-共同靶点-疾病”网络。

1.5 构建蛋白相互作用网络(PPI)

将收“药物-疾病”共有基因导入STRING平台(https：//string-db.org/)，在Organism选项中选择Homo sapiens，其余参数保持默认，构建PPI，结果保存为TSV格式[17]。将PPI 网络模型导入Cytoscape 3.7.2软件，运用“Network Analysis”功能，筛选出关键靶点基因，构建PPI网络图。

1.6 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析

将关键靶基因导入DAVID数据库(https：//david.ncifcrf.gov/)进行GO(Gene Ontology)和 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析，下载通路数据文件。再将分析数据导入微生信平台(http：//www.bioinformatics.com.cn/)，进行可视化分析，分别绘制GO功能富集柱状图和KEGG富集分析气泡图。

1.7 成分-靶标-通路网络构建

将筛选的活性化合物、靶点及重要信号通路导入构建Cytoscape软件对可视化网络构建及分析。

2 结果

2.1 栀子活性成分及药物靶点的筛选结果

利用TCMSP数据库筛选得到14个符合条件的活性化合物(见表1)和219个靶基因，其中异欧前胡素、苏丹红、角鲨烯3种化合物无法筛选出靶点信息，则通过Swiss Target prediction和Similarity Ensemble Approach数据库进行收集，其中Swiss Target Prediction中靶点以Probility>1作为筛选条件，Similarity ensemble approach(SEA)以Probility>0.5作为筛选条件。将以上3部分靶基因进行整合，删除重复值，共计得到341个靶基因。

2.2 痛风相关靶点的收集

以“Gout”为关键词分别从 DisGENT(Score≥0.3)、GeneCards(Relevance score>1)和OMIM中检索9、778和81个与痛风相关靶点，去除重复值，共805个。

表1 栀子的化学成分信息

2.3 “药物-活性成分-共同靶点-疾病”网络图构建

将栀子活性成分相关的341个靶点与痛风805个靶点进行Venn分析，获得52个交集靶基因(见图1)。借助 Cytoscape 3.7.2软件进行可视化处理，构建“药物-活性成分-共同靶点-疾病”网络图，网络中共有66个节点，170条边，见图2。槲皮素(MOL000098)、β-谷固醇(MOL000358)、山柰酚(MOL000422)等的度值较高，以上化合物可能是栀子治疗痛风的关键化合物。

注：List1代表药物基因；List2代表疾病基因。

注：六边形代表疾病；菱形代表药物；矩形代表药物成分；椭圆形代表作用靶点。

2.4 靶蛋白相互作用(PPI)网络的构建及分析

借助STRING数据库及Cytoscape软件共筛选出26个关键靶点，并绘制出栀子治疗痛风关键靶点网络，如图3所示。蛋白互作网络中有 26个节点和 293条边，平均中心自由度为22.5。26个关键基因分别为VEGFA、TNF、CXCL8、EGF、IL-1β、PTGS2、CCL2、IL10、MMP9、JUN、IFNG、ICAM1、FOS、VCAM1、RELA、PPARG、CD40LG、CRP、SPP1、TGFB1、MMP1、STAT1、IL1A、SELE、MMP3、CXCL2。其中VEGFA度值最高，其次为TNF、CXCL8、IL-1β，表明这些蛋白可能是栀子治疗通风的关键靶点。

注：图中节点大小代表Degre值，连线粗细代表Combine score值。

2.5 GO分析及KEGG信号通路分析

利用DAVID数据库对26个核心潜在靶点进行GO富集分析，设定参考值，PValue<0.01，共收集信号通路255条。按照PValue<0.01，Count>=5，共筛选得出36个条目。继续导入微生信平台进行GO富集分析。详见图4。

图4 栀子抗痛风潜在作用靶点GO分析

其中生物过程(BP)条目23个，包括：炎症反应(Inflammatory response)、RNA聚合酶II启动子转录的正调控(Positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)、药物反应(Response to drug)等。细胞成分(CC)条目6个，主要富集到细胞外空间(Extracellular space)、细胞外区域(Extracellular region)、细胞表面(Cell surface)、质膜的外侧等(External side of plasma membrane)。分子功能(MF)条目7个，涉及蛋白结合(Protein binding)、细胞因子活性(Cytokine activity)、相同的蛋白结合(Identical protein binding)、蛋白质同二聚活动(Protein homodimerization activity)等。

利用DAVID数据库对26个核心潜在靶点进行KEGG富集分析，共收集到信号通路58条，按照PValue<0.01，且Count≥8筛选信号通路有18条，如图5。表明栀子治疗痛风的作用机制主要涉及类风湿性关节炎、肿瘤坏死因子信号通路、癌症通路、NF-kappa B信号通路、Toll-like受体信号通路、MAPK信号通路等，其中作用靶点富集最多通路有类风湿性关节炎、肿瘤坏死因子信号通路，均含有13个基因。与通路相关的基因见表2。

图5 栀子抗痛风潜在作用靶点KEGG通路富集分析

表2 KEGG 通路富集分析相关基因

2.6 “药物-活性成分-靶点-通路”网络的构建与分析

将栀子的活性化合物与筛选的显著性PValue<0.01，且Count≥8的18条信号通路及其作用核心靶点基因结合，应用Cytoscape 3.7.2软件构建网络。如图6所示，由图可知，共9种活性化合物作用于上述18种信号通路，其中槲皮素(MOL000098)、β-谷固醇(MOL000358)、山柰酚(MOL000422)发挥重要作用；TNF、IL1β、RELA、JUN、FOS可能是栀子抗痛风的关键靶点。

注：长方形表示通路；六边形表示潜在靶点基因；椭圆形表示化合物；三角形表示药物。

3 讨论

本文采用网络药理学分析方法，共筛选出栀子有效活性化合物11个，获得“药物-疾病”共同基因靶点52个，分析“药物-活性成分-共同靶点-疾病”网络图，发现栀子抗痛风关键化合物有槲皮素、β-谷固醇、山柰酚等，其中槲皮素治疗痛风发挥主导作用。槲皮素和山柰酚都是黄酮类化合物，两者均能通过抑制黄嘌呤氧化酶活性，降低血清中尿酸含量[18-20]。β-谷固醇是一种天然植物甾醇和抗氧化剂，用于治疗动脉粥样硬化、糖尿病、癌症和炎症[21]。研究表明，β-谷甾醇可减少NO合成，抑制巨噬细胞IL-6活性，减少IL-1β、TNF-α等炎性因子的分泌[22]。

根据PPI分析可知，栀子抗痛风核心靶点共26个，其中VEGFA、TNF、CXCL8、IL1β可能是栀子抗痛风的主要作用靶点。VEGFA对血管中内皮细胞的增殖、迁移及分化具有重要作用，同时有抑制免疫的功能[23-24]。TNF-α是一种炎性因子，可参与T-cell、B-cell的活化。黄潇等[25]发现栀子提取物能通过抑制炎症因子TNF-α的合成与释放而发挥抗炎作用。王苗慧等[26]发现痛风性关节炎大鼠关节肿胀明显，踝关节浸出液中IL-1β、IL-8和TNF-α含量明显高于正常组。Wan等[1]研究发现，痛风会导致患者体内TNF-α和IL-1β水平升高。

GO功能富集分析显示栀子抗痛风主要集中于炎症反应、RNA聚合酶II启动子转录的正调控、药物反应、细胞外空间、细胞外区域、细胞表面、质膜外侧、蛋白结合、细胞因子活性、相同的蛋白结合、蛋白质同二聚活动等。

KEGG通路富集分析显示，栀子治疗痛风有多条通路，其中包括癌症通路以及TNF信号通路、NF-kappa B信号通路、Toll-like受体信号通路、MAPK信号通路等。TNF信号通路与癌症密切相关，而炎症是肿瘤的一种特征反应，TNF-α可激活MAPK信号通路，促进HIF-1α合成[27]。缺氧条件下，HIF-1α大量表达，可促进COX-2的表达[28-29]。Toll-like受体(TLRs)，具有识别入侵病原体和内源性有害刺激的功能，从而参与免疫反应。在TLRs中，TLR4是主要的脂多糖(LPS)受体[30-31]。当脂多糖受体被激活时，经过复杂的级联反应，使NF-kappa B信号通路被激活[32]。NF-kappa B是一类重要的核转录因子，参与免疫反应、炎症反应和细胞分化等，研究证明干扰NF-kappa B的活化，能阻断多种细胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-6)的合成和释放[33]。

综上所述，本文通过网络药理学方法预测栀子主要活性成分抗痛风的药效基础以及潜在的作用机制，表明栀子可通过多靶点、多通路治疗痛风。但网络药理学分析仍然存在一定局限性，后续还应通过实验进一步进行研究和完善。