李晓丽,王洪江,池洪杰

心肌梗死是由于冠状动脉供血不足，引起心肌细胞不可逆死亡，导致的心功能障碍和衰退[1-2]。近年来文献证实，自噬参与了心肌梗死的发生发展[3]。曲美他嗪(TMZ)是细胞保护类药物，可改善心肌的能量代谢，增强其缺血耐受性，是临床广泛用于缓解心绞痛的经典药物[4]。ZHANG等[5]发现，TMZ可以保护心肌细胞，减少细胞凋亡和自噬，降低心肌纤维化，改善心功能。马晓玮等[6]发现,TMZ可通过转化脂肪与糖代谢，增强原代心肌细胞存活能力。此外，TMZ还被发现可通过提高超氧化物歧化酶(SOD)活性，减轻细胞凋亡[7]。但是关于TMZ保护心肌细胞、减轻心肌损伤的作用，是否与mTOR信号通路调控自噬水平有关，目前尚不明确。本研究采用TMZ处理原代乳鼠心肌细胞损伤模型，观察TMZ对缺血损伤心肌细胞的保护机制。

1 材料与方法

1.1细胞分组及处理 采用胰酶胶原酶消化法和差速培养法分离培养SD大鼠乳鼠原代心肌细胞，在10%胎牛血清(FBS，GIBCO)的DMEM培养基培养，应用1 μmol/L血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)处理，建立心肌细胞损伤模型。分别采用10、50和100 μmol/L的TMZ预处理损伤心肌细胞，以探索最佳TMZ处理浓度。本研究TMZ最佳处理浓度为50 μmol/L。对照组(Control组)：在DMEM培养基中培养48 h，饥饿12 h，继续用DMEM培养基培养12 h；模型组(Model组)：DMEM培养基中培养48 h，饥饿12 h后，在DMEM培养基中加入1 μmol/L AngⅡ继续培养12 h；Model+TMZ组：在Model组基础上加入50 μmol/L的TMZ共同培养12 h；Model+1 mmol/L的mTOR阻滞剂西罗莫司(RAPA)组：在Model组处理基础上加入1 mmol/L的RAPA共同培养12 h；Model+TMZ+RAPA组：在Model+TMZ组处理基础上加入1 mmol/L的RAPA共同培养12 h。所用试剂均来源于Sigma Aldrich。

1.2流式细胞仪检测细胞凋亡 Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)染色法用于检测处理后的心肌细胞凋亡率。将不同分组处理的乳鼠原代心肌细胞消化收集于离心管中，以1000 r/min离心5 min，PBS洗涤2次后，以膜联蛋白V-FITC结合缓冲液重悬，分装至1.5 ml EP管中，每管500 μl。膜联蛋白V-FITC/PI(BD Pharmingen，USA)用于在黑暗中染色细胞。最后，通过在荧光激活细胞分选流式细胞仪(BD Pharmingen， USA)上PI和膜联蛋白V阳性细胞来评估凋亡细胞。实验重复3次。

1.3微板法检测乳酸脱氢酶(LDH)和SOD水平 LDH检测：按照10×104个/孔细胞数将乳鼠原代心肌细胞悬浮液接种于6孔板，正常培养24 h。按照分组给予不同处理后转移至2 ml EP管中，离心取上清。按照LDH测试盒(南京建成生物)说明书依次加入试剂和样本。SOD检测：将不同分组处理的细胞洗涤后转移至1.5 ml EP管中，使用超声破碎机碎裂细胞，离心取上清，按照SOD测试盒(南京建成生物)说明书严格操作。分别室温静置5 min，15 min后采用全波长酶标仪(美国Thermo公司)检测细胞上清液LDH和SOD水平，于450 nm波长处测定光密度值，并计算浓度。实验重复3次。

1.4蛋白质免疫印迹试验检测相关蛋白表达 将不同处理的心肌细胞离心后弃上清，预冷PBS洗涤2次，吸去瓶内剩余液体，加入细胞裂解液(上海碧云天)，2～3 min后刮出细胞，于1.5 ml EP管中，冰上孵育25 min。低温高速离心15 min后吸取细胞总蛋白。BCA法测定蛋白浓度。根据文献[8]中方法检测目标靶蛋白表达。一抗采用抗LC3-Ⅰ/Ⅱ、P62、Bax、Bcl-2、Caspase-3及mTOR，根据抗体稀释比例预先配置，以上抗体均购自英国Abcam公司。与HRP偶联的山羊抗兔(鼠)二抗，在37 ℃温育2 h。目标蛋白采用ECL蛋白免疫印迹试验检测试剂盒(FulenGen，广州，中国)进行可视化。

1.5荧光共聚焦检测细胞内自噬小体及自噬流 按8×103个/孔稀释细胞悬液，接种至Φ15 mm共聚焦培养皿内，正常培养24 h。依据CYTO-ID®Autophagy Detection Kit 2.0(美国 Enzo Life Sciences公司)说明书配置试剂，避光操作。将不同处理的细胞弃培养基，用含5% FBS 1x Assay Buffer洗涤2次，加入配置好的检测试剂150 μl，正常培养30 min。弃检测试剂，用含5% FBS 1x Assay Buffer洗涤3次。加入4%多聚甲醛2 ml，室温放置15 min。吸去多聚甲醛，用1x Assay Buffer洗涤3次。后加入200 μl 1x Assay Buffer，4 ℃避光保存。采用激光共聚焦扫描显微镜(日本尼康)检测细胞内自噬小体及自噬流，激发光波长488 nm，观察并拍照，绿色荧光代表自噬泡，蓝色表示细胞核。

2 结果

2.1TMZ对损伤心肌细胞凋亡的影响 Control组、Model组、Model+TMZ组、Model+RAPA组、Model+TMZ+RAPA组心肌细胞凋亡率分别为(4.83±1.25)%、(19.24±1.59)%、(7.95±0.71)%、(18.49±1.58)%、(15.54±1.16)%。Model组细胞凋亡率高于Control组，Model+TMZ组低于Model组，Model+RAPA组和Model+TMZ+RAPA组高于Model+TMZ组(P<0.05)。见图1。

图1 TMZ对心肌细胞损伤大鼠心肌细胞凋亡的影响 TMZ为曲美他嗪，RAPA为西罗莫司

2.2心肌细胞损伤标志物检测 Model组LDH水平高于Control组，TMZ处理后显著下降，Model+RAPA组和Model+TMZ+RAPA组均高于Model+TMZ组(P<0.05)；Model组SOD水平低于Control组，TMZ处理后明显上升，Model+RAPA组和Model+TMZ+RAPA组均低于Model+TMZ组(P<0.05)。见表1。

2.3心肌细胞自噬流检测 Model组心肌细胞自噬荧光积累，自噬小体形成，自噬流增加；Model+TMZ组自噬荧光少于Model组；Model+RAPA组和Model+TMZ+RAPA组自噬荧光较Model+TMZ组增加。见图2。

表1 5组大鼠心肌细胞损伤标志物水平比较

图2 5组大鼠心肌细胞内自噬小体及自噬流荧光共聚焦检测结果 TMZ为曲美他嗪，RAPA为西罗莫司

2.4TMZ对心肌细胞自噬及凋亡相关蛋白、通路蛋白的影响 Model组LC3-Ⅰ/Ⅱ、Bax、Caspase-3蛋白表达水平高于Control组，TMZ处理后表达水平下降，Model+RAPA组和Model+TMZ+RAPA组高于Model+TMZ组(P<0.05)。Model组P62、Bcl-2、mTOR水平低于Control组，TMZ处理后表达水平上升，Model+RAPA组和Model+TMZ+RAPA组低于Model+TMZ组(P<0.05)。见图3。

3 讨论

流式细胞术和微板法是检测心肌细胞凋亡的经典方法。本研究结果显示，与Model组比较，给予TMZ处理可以降低LDH水平，升高SOD水平和心肌细胞存活率。表明TMZ保护心肌细胞免受AngⅡ诱导的细胞损伤。细胞凋亡是细胞Ⅰ型程序性死亡，在心力衰竭发展过程中不可缺少[9]。本研究结果显示，TMZ处理可明显降低心肌细胞凋亡率，但是该作用可被RAPA抑制。表明mTOR通路在TMZ减轻心肌细胞损伤中发挥重要作用。因此，RAPA可作为mTOR通路抑制剂而用于进一步探讨TMZ抑制自噬的机制。

图3 5组大鼠心肌细胞自噬及凋亡相关蛋白、通路蛋白的表达情况

mTOR已被证明对自噬具有调控作用[10]。研究证实mTOR激活在心脏保护中起着至关重要的作用[11]。激活mTOR能够调节抗凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白Bax，抑制Caspase家族的激活和减少死亡基因表达[12]。本研究结果显示，Model组Caspase-3及Bax蛋白表达高于Control组，Bcl-2蛋白表达低于Control组，而TMZ预处理后可降低Caspase-3及Bax蛋白表达，升高Bcl-2蛋白表达，这些作用被RAPA部分抵消。本研究结果还显示，损伤心肌细胞中自噬小体的数量和LC3-Ⅱ的表达增多，而P62蛋白表达减少。P62蛋白是自噬底物，TMZ预处理后发生明显逆转，却被RAPA抑制。进一步研究结果显示，TMZ预处理可激活mTOR通路，导致自噬下调；抑制mTOR通路后，自噬减弱。表明TMZ减轻心肌细胞损伤及凋亡的潜在机制可能是通过激活mTOR信号通路而抑制过度自噬实现的。FAN等[13]证实丹参素可激活mTOR通路抑制过度自噬及凋亡而减轻心肌细胞损伤。HUANG等[14]发现microRNA-21可激活AKT/mTOR通路抑制心肌细胞过度自噬，减轻心肌细胞损伤。本研究结果与报道一致。

本研究在体外模型中证实TMZ可通过激活mTOR来抑制过度自噬，减轻心肌细胞损伤。TMZ与自噬间的相互作用可为预防心肌细胞损伤和凋亡提供参考。关于自噬激动剂和抑制剂评估TMZ的心脏保护作用及其确切的分子机制，还需要更深入的研究，以期为心肌梗死提供新的治疗靶点。