程汉

关键词：禽流感;免疫抗体;血凝;血凝抑制试验

1 材料及方法

1.1 实验材料

1.1.1 1%红细胞悬液

采集至少3只SPF公鸡或无禽流感或新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积阿氏液混合，用PH7.2、0.01mol/LPBS液或生理盐水洗涤3次，每次均以1000r/min，洗涤后用PBS或生理盐水配制成体积分数为1%红细胞悬液，4℃保存备用。

1.1.2 诊断液

标准禽流感（H4、H6）病毒抗原、标准禽流感（H4、H6）阳性血清，由农业农村部动物疫病诊断液制备中心提供。

1.1.3 仪器

96孔V型微量反应版，移液器，微量振荡器等。

1.1.4 被检血清样品

来自睢宁县各地相当规模的鸡场的鸡群，每个鸡群随机采取健康鸡血样，翅静脉采血2ml/羽，20℃以下气温24h后大部分血清自动析出，可直接检测，不能自动析出的则进行离心分离血清，当天来不及检测的则将血清分离至4℃保存。

1.2 检测方法及步骤

该试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法，用来检测禽血清中的免疫抗体。按照《GB/T18936-2003高致病性禽流感诊断技术》采用血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验，利用血凝素（HA）蛋白的抗体与受体的特异性结合能够干扰HA蛋白与红细胞受体的结合从而出现抑制现象，用来检测禽血清中的免疫抗体，在进行HI试验之前必须先进行HA试验，以确定HI试验中所用抗原的HA滴度。完成HA试验后，以4个HA单位的抗原进行HI试验，以完全抑制4个血凝单位抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度，抗体效价以㏒2表示。

1.2.1 血凝（HA）试验

（1）在v型微量反应板的1～12孔均加入0.025ml

PBS或者生理盐水。

（2）吸取0.025mL病毒悬液（病毒抗原），加入第1孔，混匀。

（3）从第1孔吸取25ul病毒悬液加入第2孔，混匀后吸取25ul加入第3孔，如此进行倍比稀释至11孔，从第11孔吸取25ul，弃去。……