郑 志，姜林娟，朱绍辉，朴丙熙，權英珠

1)新乡医学院公共卫生学院卫生毒理学教研室 河南新乡 453000 2)江苏韩陵医药研究院有限公司 南京211100 3)新乡医学院第一附属医院普通外科 河南卫辉 453100 4)莱帕坚公司 韩国首尔 04393 5)梨花女子大学药学院 韩国首尔 04393

有研究[1]表明，肥胖发生与肠道微生物具有密切的关系，调节肠道菌群及其代谢产物已成为防治肥胖及慢性疾病的新热点。膳食纤维方案可以改变肠道微生物结构，调节肠道菌群平衡，保护肠道健康，还能协同药物有效地降低慢性病发病率。但如何选择高品质膳食纤维结构并合理搭配，是膳食纤维方案应用过程中的重点研究内容之一[2-4]。现代微生物体外发酵法具有较好的优势，该方法源于传统发酵原理，借助微生物和酶的体外催化分解作用，将一些不可溶的纤维素降解为短链的可溶纤维素，使之更容易被人体吸收。有研究[5-6]调查发现，海带膳食干预不仅能调控肠道菌群平衡，还具备减重功效。本研究基于海带的减肥作用，选用具有肠道菌群平衡功能的3种益生菌(鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌、乳双歧杆菌)，利用体外发酵技术，制成益生菌-海带复合发酵液，探讨其对高脂饲料诱导肥胖模型大鼠肠道菌群的影响及防治肥胖的效果，旨在为防治肥胖的膳食策略研究奠定基础和提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器海带丝购自大连新兴龙海产品有限公司，鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌、乳双歧杆菌经韩国莱帕坚公司筛选，由江苏韩陵医药研究院有限公司赠送。脂肪供能高脂饲料购于江苏协同医药生物工程公司。MRS培养基和胰蛋白胨大豆肉汤购于青岛海博生物公司。丁酸和丙酸标准品、4-甲基戊酸(内标物)、乙醚购于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。粪便基因组DNA提取试剂盒购于美国Zymo Research公司。CX21光学生物显微镜(日本奥林巴斯公司)，HZQ-F160A恒温振荡培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)，754紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)，5804R高速冷冻离心机(德国艾本德股份公司)。7890型气相色谱仪和DB-FFAP毛细管柱(美国安捷伦公司)。

1.2 益生菌-海带复合发酵液和益生菌发酵液的制备将鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌、乳双歧杆菌分别放入MRS培养基中，37 ℃培养48 h进行活化。将活化后的益生菌分别接种到100 mL胰蛋白胨大豆肉汤中培养直至达1×107个菌落形成单位(colony forming unit，CFU)/mL(pH 7.4)。每种益生菌各取30 mL混合，再放入100 g除盐灭菌海带丝，37 ℃条件下发酵72 h，0.48 μm滤纸过滤，得到益生菌-海带复合发酵液。另外，每种益生菌各取30 mL混合，同上发酵、过滤，制备益生菌发酵液(无海带处理)。

1.3 肥胖大鼠模型的建立[7]及分组40只7周龄雄性SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术公司。饲养环境温度(21±1) ℃，湿度(54±2) %，光和暗周期12 h，单笼饲养，自由饮水饮食，每天称重1次。随机选取10只给予普通饲料+普通饮水(正常对照组)。余30只大鼠进行1周适应性饲养后利用高脂饲料诱导肥胖，8周后体重增加30%以上，被认为肥胖模型建立成功。肥胖大鼠随机分为：肥胖对照组(高脂饲料+普通饮水)、益生菌发酵组(高脂饲料+体积分数10%的益生菌发酵液)、益-海复合发酵组(高脂饲料+体积分数10%的益生菌-海带复合发酵液)，每组10只。干预时间为8周。

1.4 大鼠体重、日均食物摄取量的检测每日同一时间更换饮水，每周同一时间测体重。记录每周食物摄取量。计算实验前后体重增加量和日均食物摄取量。大鼠处死前1天，计算24 h内饮水量。

1.5 结肠内容物的获取干预8周后处死大鼠。大鼠处死前需空腹(仅给予饮水)12 h，然后乙醚麻醉、破腹，最后取结肠组织。持灭菌镊子挤出结肠内容物，置于冻存管内，-80 ℃保存，用于分析肠道菌群结构以及丁酸、丙酸含量。本实验在新乡医学院伦理委员会的审查和监督下完成。

1.6 肠道菌群结构分析利用粪便基因组DNA提取试剂盒，提取肠道内容物基因组DNA，依托韩国喜灵(株)生物有限公司，采用焦磷酸测序法[8]分析肠道菌群结构，应用CLcommunityTMCd-hit[9]的基因数据库，以97%基因相似度为依据，鉴别菌种属的微生物操作分类单元水平，确定微生物菌属。

1.7 结肠内丁酸和丙酸含量的测定结肠内容物与1×PBS灭菌缓冲液均匀混合，加入体积分数1%的甲酸，4 ℃混匀1 h。取1 mL混合样品，加1 mL乙醚，加500 mL 700 μmol/L的4-甲基戊酸(内标物)，充分混匀，离心，萃取上清。采用气相质谱仪分析，条件如下：载气是流速0.75 mL/min的氦气。进样器温度为220 ℃，离子源和界面温度为250 ℃。加热箱初始温度为90 ℃(2 min)，温度以5 ℃/min的速度升至80 ℃(10 min)，然后以10 ℃/min的温度升至200 ℃(15 min)，最后以20 ℃/min 的温度升至250 ℃(2 min)。检测器扫描范围为30～350 m/z，以丁酸、丙酸标准品绘制标准曲线，利用标准曲线计算肠道中丁酸和丙酸的含量。

1.8 统计学处理应用SPSS 25.0处理数据，4组大鼠的体重增加量，日均食物摄取量，处死前1天饮水量，肠道菌群优势菌属相对丰度，厚壁菌/拟杆菌比值，肥胖相关菌群、抗肥胖相关菌群、免疫调节相关菌群相对丰度，丁酸、丙酸含量的差异采用单因素方差分析和LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 4组大鼠体重增加量、日均食物摄取量和处死前1天饮水量比较见表1。益-海复合发酵液比单一益生菌发酵液对体重有更显著的抑制效果。

2.2 4组大鼠肠内菌群结构4组大鼠肠道菌群优势菌属的相对丰度比较见表2。4组大鼠肠道菌群厚壁菌/拟杆菌比值和各类菌群相对丰度的比较见表3。与正常对照组及肥胖对照组比较，益生菌发酵组和益-海复合发酵组的肥胖相关肠道菌群(罗氏菌属[10]、柔膜菌纲[11]、丹毒丝菌纲[12]、颤螺旋菌属[13])的相对丰度降低；抗肥胖相关肠道菌群(普雷沃氏菌属[14]、另枝菌属[15]、拟杆菌属[16])的相对丰度升高。

表2 4组大鼠肠道菌群优势菌属相对丰度的比较(n=10) %

2.3 4组大鼠肠道丁酸、丙酸含量见表4。与肥胖对照组比较，益生菌发酵和益-海复合发酵组大鼠肠道丁酸、丙酸含量增加；与益生菌发酵组比较，益-海复合发酵组肠道丁酸、丙酸含量增加。

表4 各组大鼠肠道丁酸、丙酸含量比较 mmol/L

3 讨论

3.1 益生菌与褐色海藻的肥胖防治效果益生菌有降脂功效，不仅可通过改善高脂饮食造成的脂代谢异常、下调体内脂多糖含量[17]，显著降低肠黏膜中紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达[18]，还能增加肠道通透性[19]，改善肥胖儿童BMI、体脂、糖脂代谢水平、炎症状态[20]，控制食欲[21]。褐色海藻含有丰富的植物纤维素，膳食海藻能抑制α-葡萄糖苷酶活性，增加肌肉葡萄糖摄取，降低转录因子C/EBP-α/β、过氧化物酶体增殖物激活受体γ、血清脂联素[6]，激活胰岛素信号相关蛋白[22]，具有抗肥胖功效。此外，益生菌及复合发酵液还可能通过平衡肠道菌群(肠-脑轴)，影响食欲调节激素如廋素、胃促生长素、胰高血糖素样肽-1等，降低食物摄取量，减少肠道对食物的吸收[23]。本研究结果发现膳食益生菌-海带复合发酵液更能有效地抑制肥胖大鼠的体重增长，降低饮水量以及食物摄取量，说明海带与益生菌搭配的膳食方案，可能具有协同抗肥胖功效。

3.2 膳食纤维素的提取方法为获取优质的膳食纤维，需要采用化学法、物理法、酶解法和生物发酵法进行提取。其中，最常用的方法是酶解法和生物发酵法。Li等[5]报道，采用酶解的方法从褐色海藻中提取不饱和海藻酸寡糖，能通过增加AMP活化蛋白激酶α、乙酰辅酶A羧化酶磷酸化，发挥抗肥胖作用。此外，采用热酸和褐藻酸裂解酶方法提取的褐色海藻多糖，也通过AMP激活途径，下调固醇调节元件结合蛋白1和脂肪酸合成酶，抑制脂质合成，发挥减重功效，但对肠道微生物的作用机制仍需要进一步探索[24]。本研究采用的微生物体外发酵方法，能弥补一些不溶性膳食纤维素及活性成分需要经过肠道菌分解才能被吸收的缺陷，在提高健康效果方面具有独特优势。

3.3 益生菌-海带复合发酵液对肠道菌群结构的影响合理搭配膳食结构，能促进肠道中优势菌的生成，提高微生物生成酶活性，增强机体免疫功能，促进人体健康[25]。哺乳动物的肠道优势菌群为厚壁菌门和拟杆菌门，分别占肠道总菌群的50%～80%和10%～30%；此外，还有1%～20%的变形杆菌门和3%～15%的放线菌门。本研究结果显示高脂饮食引起肠道内厚壁菌富集和拟杆菌相对丰度降低，对肠道菌群代谢产生影响。肥胖者肠道中90%微生菌是厚壁菌门的芽孢杆菌属、梭菌属、乳杆菌属，另外10%微生菌是拟杆菌门的产酸拟杆菌属、吉氏拟杆菌属、脆弱拟杆菌属[26]。本研究结果显示4组肠道菌群中厚壁菌门和拟杆菌门是肠道内的优势菌；益-海复合发酵组肠道肥胖相关菌群相对丰度下降，抗肥胖相关菌群相对丰度升高。有研究[27]表明，高脂食物诱导肠道中发挥免疫功能的乳酸杆菌、变形菌门的丰度增加，而拟杆菌门丰度减少，认为厚壁菌/拟杆菌比值增大可能与体重增加、发育受损、肝脏组织及功能异常、肠道菌群多样性降低有关。本研究结果表明益-海复合发酵组厚壁菌门相对丰度下降，而拟杆菌门相对丰度升高，导致厚壁菌/拟杆菌比值降低，说明益生菌-海带复合发酵液对高脂饮食诱导的肥胖大鼠肠道菌群有改善功能。本研究亦发现益生菌-海带复合发酵液使肠道毛螺菌科、瘤胃球菌科、理研菌科及拟杆菌科菌群增加。毛螺菌和瘤胃球菌科与血脂、总胆固醇变化[28]有关，具有抑制癌细胞发生[29]、抗炎、促进短链脂肪酸生成的效果[30]。理研菌科及拟杆菌科的丰度增加与免疫应答提高有关[31]。本研究结果亦表明，益生菌-海带复合发酵液使大鼠肠道的梭菌纲、苏黎世杆菌属、普雷沃氏菌科、紫单胞菌科菌群减少。肠道梭菌科和苏黎世杆菌的丰度与分泌型免疫球蛋白A呈负相关[32]，而肠道普雷沃氏菌科和紫单胞菌科与小鼠胆汁酸代谢紊乱有关[33]。综上，膳食益生菌-海带复合发酵液能显著调节肠道菌群结构。

3.4 益生菌-海带复合发酵液对短链脂肪酸生成的影响高脂饮食改变肠道微生物结构，导致短链脂肪酸合成量产生变化。褐色海藻含有丰富的纤维素，被人体摄取，在肠道由微生物发酵，生成短链脂肪酸，促进能量代谢。肠道菌群在丁酸、丙酸和乙酸等短链脂肪酸的合成中起着积极的作用[34]。丙酸合成量的增加能产生饱腹感，减少高脂肪诱导的肝脏组织的脂肪变性、肥大，还可有效降低空腹胰岛素水平，改善脑血管功能[35]；丁酸具有抗炎效果，能增强肠道屏障功能及黏膜免疫，促进肠道激素分泌，维持肠道屏障的完整性[36]。因此，肠道短链脂肪酸合成量的增加能促进人体肠道健康。本研究结果表明益-海复合发酵组大鼠结肠中丙酸和丁酸的含量增加，提示益生菌-海带复合发酵液能通过提高肠道短链脂肪酸水平来抵抗高脂饮食诱导的肥胖。

总之，现代体外微生物发酵法是发酵纤维素研究的新领域。本研究应用的膳食益生菌-海带复合发酵液方案，通过减少肠道厚壁菌，增加拟杆菌，降低厚壁菌/拟杆菌比值，调节肠道菌群结构；通过增加短链脂肪酸生成，改善肠健康；可抑制肥胖型大鼠的体重增加，对肥胖防治的研究具有良好价值。本研究还存在一定局限性，益生菌与海带对肠道菌群的具体相互干预机制尚需进一步深入探究。