李 霞，杜 娟，杨晓梦，普晓英，杨加珍，杨 涛，李玉萍，曾亚文

(1. 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所/云南省农业生物技术重点实验室，昆明 650205; 2. 玉溪农业职业技术学院，云南 玉溪 653106)

【研究意义】云南稻种资源丰富，有色米资源几乎占云南地方稻种资源的一半[1]。有色稻米种皮富含天然色素，在抗癌[2]、抗炎症[3]、抗菌、保护视力、预防心血管疾病和糖尿病等方面都具有重要生理功能[4-6]。其中红米是有色米中数量最多的一类，对云南红米种质资源进行系统鉴定与利用，将有助于功能稻米品种选育。【前人研究进展】红米的遗传模式研究发现，种皮颜色性状大多属于质量性状，由1对显性基因控制。石帮志等[7]利用红米材料‘天红’和8种白米水稻材料对种皮颜色性状遗传模式进行分析，结果显示F1代种皮颜色均为红色，而对应F2分离群体中种皮颜色红和白的分离比为3∶1，表明‘天红’的红色种皮性状受1对独立的显性基因控制。赵辉等[8]用绿色果皮的紧穗野生稻和白色果皮的栽培稻‘中花九号’进行杂交，利用BC4F2群体确定红色种皮的性状受1对显性基因控制。相似的结果也出现在王丽华等[9]利用红米水稻品种‘红金石’和白米品种进行遗传模式分析的研究中，以上结果均说明红色种皮的性状是受1对显性基因控制的。但也有少数研究表明，红米种皮颜色受两对显性基因控制或呈现数量遗传特性。廖金花等[10]选择红米品种‘红宝石’和四个恢复系进行种皮颜色性状遗传分析，发现其F2代群体中种皮颜色在红色中又有深红、浅红、粉白之分，其三者之和和白色的分离比为15∶1，以上结果表明‘红宝石’的种皮颜色性状由两对具有互补作用的显性基因控制的。随着生物学技术的不断发展，国外学者对红米种皮颜色基因的研究发现，该基因位点位于第7染色体，隐性白米种皮无着色是源于Rc基因第6外显子内的14 bp缺失，缺失导致该基因失去功能[11]。国内学者通过对长雄野生稻、红宝石及红米品种培杂191的种皮颜色基因定位也得到相似的结论，初步定位结果均显示种皮颜色基因位于第7染色体上，红白米之间Rc基因存在类似的缺失变异[12-13]。【本研究切入点】红米种质‘rm257’，是一份优异的功能稻米育种材料，具有良好的应用前景和遗传研究价值。但针对该红米资源的遗传研究尚未开展，那么该红米种质种皮颜色遗传模式如何，该性状受几对基因控制，是否与红米种皮颜色基因Rc直接相关？这些都是高效利用该材料进行有色米新品种选育所需解决的问题。【拟解决的关键问题】利用云南高黄酮红米种质‘rm257’与9份云南地方白米品种构建测交组合及F2分离群体，通过观察统计其种皮颜色分离情况，推测其遗传模式；同时利用Rc基因变异缺失位点序列开发功能标记，再利用F2分离群体进行验证，初步明确红米种质‘rm257’种皮颜色与Rc基因的关系；并利用96份云南地方核心种质材料对该功能标记的通用性进行检验。

1 材料与方法

1.1 试验材料

材料：高黄酮红米材料‘rm257’，9份云南地方种白米材料毫换、合系35、曼丫谷、昌宁糯、高脚糯、黄壳糯、旱扬谷、毫门共、白酒谷。9个测交组合及其F2分离群体。地方种材料：96份云南地方种质材料，其中包括51份白米材料，45份红米材料。以上材料分别种植于云南省农业科学院嵩明基地。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA提取 田间取幼嫩叶片，CTAB小样法提取基因组总DNA，紫外分光光度计检测DNA质量及浓度，稀释到50 ng/μL备用。

1.2.2 功能标记开发及PCR体系Rc基因功能标记开发及检测：Rc基因(LOC_Os07g11020)全序列下载于RGAP网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)，依据已报导的Rc基因第6外显子14 bp缺失差异区段[11]，利用引物设计软件Primer5设计功能标记引物，其中RCGXL: 5′-TGAAGGAAGTGATGACAACAAGACC-3′， RCGXR5′-ATGGTTGGCACTGAAATCACCTTGG-3′，扩增结果稳定，条带清晰分别用于分离群体检验和通用性检验。

PCR反应体系总体积为25 μL：2×TsingKe Master Mix 12.5 μL，50 ng/μL DNA模板3 μL，上下游引物各1 μL，最后以7.5 μL ddH2O补平。2×TsingKe Master Mix 购买自昆明硕擎有限公司。 PCR 反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s， 30～35个循环；72 ℃ 延伸5～15 min。扩增产物用8.0%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染法显色，待条带清晰可见后，将胶片转入透明自封袋后置于白炽灯箱上照相、记录。

功能标记群体检验：利用功能标记RCGX对9个组合的F2分离群体单株基因型进行分析，基因型为RcRc和Rcrc的单株对应表型为红色，基因型为rcrc的单株对应表型为白色。最后完成基因型与对应单株种皮颜色表型的对应关系，判断Rc基因是否为‘rm257’种皮颜色性状的目标基因。

2 结果与分析

2.1 ‘rm257’遗传模式分析

‘rm257’与9个云南地方白米品种配置的测交组合发现，9个组合的F1代种皮颜色均为红色，红色种皮呈显性。次年对9个组合F2代群体单株种皮颜色考察发现，9个测交组合中，7个组合的后代主要呈现2种类型，红色和白色。通过7个测交组合的F2代单株红色种皮和白色种皮数量经卡方检验均符合3∶1的分离比(表1)，但在以毫换和合系35为父本的2个测交组合分离群体中红色类型又可分为红色和红褐色(图1)。同时对红色，红褐色，白色的单株分离情况经卡方测验也符合9∶3∶4分离比。基于以上数据表明，‘rm257’种皮颜色性状与不同测交父本表现出不同的遗传模式，在大部分组合中‘rm257’的种皮颜色主要受1对显性基因控制，而在少数组合中其种皮颜色的分离表型可能同时受到2个基因位点影响。同时以上结果也说明同一份材料在和不同材料组配时种皮颜色这一性状可能呈现不同的遗传模式的。

图1 F2分离群体种皮颜色类型

表1 种皮颜色性状在F2群体中的分离情况

2.2 分离群体功能标记验证

利用功能标记RCGX对9个测交组合进行群体验证，分析9个测交组合的1156个单株的基因型，因功能标记RCGX为共显性标记，所有测交组合分离群体单株都呈现出3种基因型RcRc、Rcrc、rcrc带型(图2)。通过统计各组合3种基因型单株数量发现，其中7个组合3种基因型基本符合1∶2∶1的分离比例，而以毫换和合系35为父本的2个测交组合分离群体中Rcrc基因型占比较高(表2)。基于以上基因型数据结合测交组合的分离群体单株种皮颜色表型，该功能标记基因型与表型呈现了一一对应关系。

M：Marker；1，2，3分别表示rcrc、Rcrc、RcRc基因型对应检测带型，下同

表2 F2分离群体功能标记RCGX基因型鉴定

2.3 RCGX功能标记的通用性检验

基于分离群体的功能标记RCGX基因型与表型间的对应性，表明该功能标记作为种皮颜色预判的一种有效技术手段，可以为红米‘rm257’的育种应用提供分子标记辅助支持。为进一步验证该标记在云南地方种质资源中的通用性，选取96份云南地方种质资源(白米51份，红米45份)，利用该标记对上述种质资源的基因型进行鉴定(图3)，通过96份材料基因型和表型的比对，同样表现出基因型与表型的一致对应，即RcRc基因型为红色种皮，rcrc基因型为白色种皮。以上结果初步表明，Rc基因在水稻红色种皮颜色中的变异是相对保守的，且云南地区多数的白米突变都是由该缺失变异导致种皮颜色变化的。

图3 功能标记RCGX检测96份地方种基因型

3 讨 论

有色米作为天然的功能性食品，其营养成分远高于普通精白米[14]。因此，研究有色米种质资源的遗传特性，可为深层次开发利用有色米资源，促进有色米产业的发展奠定基础。红米种质‘rm257’在籽粒总黄酮和抗性淀粉含量方面表现突出，分析该材料种皮颜色遗传模式，利于其在实际育种中应用。遗传分析表明，‘rm257’的种皮颜色在7个组合中表现出受1对显性基因控制，这与前人对红米遗传模式分析的实验结果相似[7-8]。但以毫换和合系35为父本的2个测交组合分离群体中红色类型又可分为红色和红褐色(图1)，与已报道的RcRd和Rcrd基因型的表型对应[15]。同时对其红色，红褐色，白色的单株分离情况进行卡方测验，符合9∶3∶4的分离比，以上结果均符合2个基因位点共同作用的遗传模式，这与廖金花等[10]的研究结果一致。综上所述，该红米种皮颜色性状遗传可能受2对基因的控制，只是针对不同的测交父本材料表现出不同的遗传模式。

针对红米种皮颜色性状相关基因，多数定位研究认为位于第7和1染色体[8-10]。已有研究证实第7染色体的Rc基因对红米种皮颜色的形成起决定性作用，Rc基因的突变导致红米变为白米[11]。因此本研究基于Rc基因开发共显性标记RCGX，对9个测交组合的F2分离群体单株基因型数据进行分析，对照每个单株的种皮颜色表型，结果呈现一一对应关系。该结果表明功能标记RCGX与种皮颜色性状共分离，加之对9份测交父本Rc基因变异区段的序列分析发现，测交父本的Rc基因序列在该区域确实存在14 bp缺失[16]。据此推测，Rc基因极有可能为控制‘rm257’种皮颜色的目标基因。而以毫换和合系35为父本的2个测交组合中，依据F2群体红色，红褐色，白色的单株分离比来看，‘rm257’种皮颜色性状可能不仅受Rc单一位点的影响。前人报道中[15]Rc基因位点正常的情况下，Rd基因位点的变异导致红褐色表型的出现，以上结果表明在这2个组合中，Rd基因可能也影响了‘rm257’种皮颜色性状，但对Rd基因的变异情况有待下一步研究。

水稻作为功能基因组研究的模式植物，近年来在该领域研究发展迅速，大批重要功能基因被分离鉴定[17]。一大批控制水稻产量[18-23]、抗病虫害[24-25]、抗逆[26-27]和营养高效[28-30]等重要农艺性状的功能基因被科学家克隆，基因的克隆为功能标记的开发提供了先决条件。由于功能标记是基于基因内突变位点开发的，与基因完全共分离，能有效解决连锁标记的问题，因此在水稻抗病[31]、耐低温[32]、抗除草剂[33-34]、水稻粒型及稻米品质育种中广泛应用[35-36]。本研究中功能标记RCGX的通用性验证表明，在大部分的云南地方稻种资源中，种皮颜色基因Rc的变异是相对保守的，所以基于Rc基因开发功能标记用于云南地方有色米资源的鉴定和育种，是行之有效的策略和途径，同时也可为云南红米品种的快速筛选提供有效的技术支持。

4 结 论

云南高黄酮红米种质‘rm257’的种皮颜色在不同测交组合中表现为受1对显性基因控制或受2个基因位点的控制及影响。功能标记RCGX与种皮颜色性状共分离，加之测交父本在Rc基因通过序列比对确实存在14 bp缺失。说明Rc基因极有可能是控制‘rm257’种皮颜色的目标基因。利用96份云南地方核心种质材料对功能标记的通用性进行检验的结果表明，Rc基因在水稻红色种皮颜色中的变异是相对保守的，且云南地区多数的白米地方种都表现出了Rc基因的缺失变异。