余欢迎 高海燕 金传山 张亚中 许凤清 张伟 王桐生 柳春风 李雷

摘要 目的：研究多花黄精不同炮制品水煎液指纹图谱及小分子糖类对其滋阴作用贡献大小顺序，建立“黄精水煎液化学成分与药效关联”的黄精质量控制模式。方法：采用灰色关联度分析方法，研究多花黄精不同炮制品水煎液高效液相色谱法（HPLC）指纹图谱及小分子糖类共有峰峰面积与环核苷酸系统比值、皮质酮以及肌酐的相关性，建立多花黄精不同炮制品水煎液滋阴作用的“谱效”关系。结果：多花黄精不同炮制品对氢化可的松致大鼠肾阴虚具有显著的改善作用，与黄精传统“滋阴”功效一致。多花黄精不同炮制品水煎液的HPLC指纹图谱中，16、1、36（果糖）、22（黃精碱A）、14、31、37（葡萄糖）号色谱峰所代表的化学成分与滋阴作用相关性较强，贡献较大，特别是36、22号色谱峰，随着蒸晒次数的增加，谱图中峰面积增加、关联度增强，可考虑作为黄精含量测定相关指标，进而完善黄精饮片的质量标准。结论：多花黄精不同炮制品水煎液与其滋阴作用之间有一定的对应关系，其水煎液HPLC指纹图谱在一定程度上可以反映黄精饮片的质量特征，炮制品中黄精碱A、果糖和葡萄糖与滋阴作用有较强的相关性。

关键词 黄精;指纹图谱;滋阴;谱效关系

Correlation Between the Yin-nourishing Effect of Aqueous Decoction of Polygonatum Cyrtonema Hua Processed Products and Its Components Based on Grey Relational Analysis

YU Huanying1，2，GAO Haiyan1，2，JIN Chuanshan1，2，ZHANG Yazhong1，3，XU Fengqing1，2，ZHANG Wei1，2，WANG Tongsheng1，2，LIU Chunfeng4，LI Lei5

（1 Anhui University of Chinese Medicine，Hefei 230012，China; 2 Anhui Province Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Decoction Pieces of New Manufacturing Technology，Hefei 230012，China; 3 Anhui Province Institute for Food and Drug Control，Hefei 230051，China; 4 Jinzhai Runyuan Biological Technology Co.，Ltd.，Lu′an 237300，China; 5 Jinzhai Senfeng Agricultural Technology Development Co.，Ltd.，Lu′an 237000，China）

AbstractObjective： To study the fingerprints of aqueous decoction of different Polygonatum cyrtonema processed products and the contribution of small molecular carbohydrates to the yin-nourishing effect，and to establish a quality control model based on the correlation between the chemical components of aqueous decoction of P.cyrtonema processed products and its efficacy. Methods： Grey relational analysis was used to study the HPLC fingerprints of aqueous decoction of different P.cyrtonema processed products and the correlation between common peak areas of small molecule carbohydrates and cyclic nucleotide ratio，corticosterone，creatinine.The spectrum-effect relationship of the yin-nourishing effect of aqueous decoction of different processed products was established. Results： Different P.cyrtonema processed products had significant improvement effects on hydrocortisone-induced kidney yin deficiency in rats，which was consistent with the traditional yin-nourishing effect of P.cyrtonema.In the HPLC fingerprints of aqueous decoction of different P.cyrtonema processed products，the chemical components represented by peaks 16，1，36（fructose），22（polygonatine A），and 14，31，37（glucose） were closely related to nourishing yin，with large contribution，especially peaks 36 and 22.With the increase in the number of steaming and drying，the peak area in the spectrum and the correlation degree increased，which could be considered as indicators to determine the content of P.cyrtonema and further improve the quality standard of P.cyrtonema decoction pieces. Conclusion： There was a corresponding relationship between the aqueous decoction of different P.cyrtonema processed products and its yin-nourishing effect.The HPLC fingerprint of the aqueous decoction could reflect the quality characteristics of P.cyrtonema decoction pieces to a certain extent，and polygonatine A，fructose，glucose were closely correlated with the yin-nourishing effect.948A108D-8E6F-4CCB-A7D0-9D02CFA49BFF

Keywords Polygonatum cyrtonema Hua; Fingerprints; Yin-nourishing effect; Grey relational analysis

中图分类号：R285.5 文献标识码：A  doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2022.09.005

黄精为百合科植物滇黄精 Polygonatum kingianum  Coll.et Hemsl.、黄精 Polygonatum sibiricum  Red.或多花黄精 Polygonatum cyrtonema  Hua的干燥根茎。酒黄精为2020版《中华人民共和国药典》收载的黄精炮制品。黄精药材经黄酒蒸制后，其外观性状发生变化的同时，补益作用随之增强。研究表明，黄精中含有多糖、皂苷、黄酮以及生物碱类等成分[1]。目前，《中华人民共和国药典》仅对多糖和浸出物的含量限度做了规定。汤剂为最传统的用药方式，水为溶剂，通过煎煮能将不同极性的成分不同程度地提取出来，保全了中药的整体性。本文利用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）技术建立多花黄精不同炮制品水煎液指纹图谱，在此基础上，采用灰色关联度方法统计分析其标定的特征峰与其滋阴作用的相关性，开展“谱效关联”的黄精质量控制模式探索性研究。

1仪器、试药与动物

1.1仪器Ultimate 3000高效液相色谱仪（Dionex公司，美国，型号：HPG-3400SD）;萬分之一分析天平（Mettler Toledo公司，瑞士，型号：ML204）;百万分之一微量分析天平（Mettler Toledo公司，瑞士，型号：XP26）;超声波清洗机（Elma公司，德国，型号：Elma S120H）;台式高速冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司，型号：TGL16M）;酶标仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司，型号：RT-6100）;恒温摇床（上海赫田科学仪器有限公司，型号：HT-111B）。

1.2试药

1.2.1试剂 黄精碱A（上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号：10362，质量分数98.0%）;5-羟甲基糠醛（上海源叶生物科技有限公司，批号：B21832，质量分数98.0%）;果糖（批号：DST200918-005，质量分数98.0%）、D-无水葡萄糖 （批号：DSTDW000501，质量分数98.0%）和蔗糖（批号：DSTDZ003801，质量分数98.0%）均购自成都德思特生物技术有限公司;氢化可的松注射液（山西省芮城科龙兽药有限公司，批号：20201101）;六味地黄丸（仲景宛西制药股份有限公司，批号：210130）;黄酒（安徽省海神黄酒集团有限公司，批号：434796）;甲醇为色谱纯;流动相用水为超纯水;其他试剂均为分析纯。

1.2.2药材多花黄精由金寨润元生物科技有限公司提供（经安徽中医药大学刘守金教授鉴定为百合科多花黄精 Polygonatum cyrtonema  Hua的干燥根及根茎），其余3种炮制品以多花黄精为原料，经安徽中医药大学炮制研究室经蒸制工艺制备而成。

1.3动物无特定病原体（Specific Pathogen Free，SPF）级雄性SD大鼠，体质量（200±20）g，由邳州市东方养殖有限公司提供，合格证号：SCXK（苏）2017-0003。动物饲养环境：温度22～26 ℃，湿度为40% ～60%，光照时间为12 h，自由饮水以及标准大鼠饲料饲养。

2方法与结果

2.1肾阴虚大鼠血液指标测定70只SPF级雄性SD大鼠，适应性饲养7 d后，随机分成空白组、模型组、阳性药组（六味地黄丸组）、生品组（黄精生品组）、两蒸组（黄精两蒸组）、四蒸组（黄精四蒸组）、九蒸组（黄精九蒸组）。肾阴虚证大鼠模型的制备方法参照文献[2]，各给药组大鼠于上午灌胃给药1次/d，连续11 d，给药容积为10 mL/kg，空白组及模型组给予等量蒸馏水。于实验的8～11 d下午，其余各组均灌胃氢化可的松注射液（50 mg/kg）。第12天，将大鼠麻醉后进行腹主动脉取血。将取好的血液放置30 min，以3 000 r/min，离心半径6.2 cm，离心15 min，将分离出的血清和血浆分装冻存，待测。严格按照试剂盒测定方法进行实验，检测大鼠血清中皮质酮（CORT）、肌酐（Cre）含量及血浆中cAMP、cGMP含量并计算得出环核苷酸系统cAMP与cGMP的比值。结果表明，两蒸、四蒸及九蒸黄精组能够显著降低肾阴虚模型大鼠血清皮质酮、肌酐水平， 对肾阴虚大鼠受损的环核苷酸系统具有显著的改善作用;生品组对肾阴虚模型大鼠的滋阴作用不明显。见图1～3。

2.2黄精不同炮制品水煎液HPLC指纹图谱研究

2.2.1色谱条件色谱柱：TechMate C18-ST（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相：甲醇（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脱（0～8 min，0% A;8～20 min，0% A～2% A;20～85 min，2% ～15% A;85～95 min，15% ～18% A;95～110 min，18% A～22%  A）;流速：1.0 mL/min;柱温：30 ℃;检测波长：

2.2.2供试品溶液的制备取一定量黄精生品及不同炮制品饮片，加10倍量水浸泡0.5 h，煎煮2次，每次1 h，滤过，合并2次滤液，浓缩，得样品水煎液（含生药0.54 g/mL）。分别量取上述方法制备的黄精不同炮制品水煎液各5.0 mL，至15 mL离心管中，加50%甲醇至10 mL，超声30 min，以4 000 r/min，离心半径8.9 cm，离心5 min，取上清，经0.22 μm微孔滤膜滤过，备用948A108D-8E6F-4CCB-A7D0-9D02CFA49BFF

2.2.3对照品溶液的制备分别取黄精碱A、5-羟甲基糠醛对照品适量，精密称定，置150 mL容量瓶中，加入25%甲醇水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成对照品储备液，其质量浓度分别为0.08 mg/mL、0.008 2 mg/mL。

2.2.4方法学考察

2.2.4.1精密度试验取同一批次两蒸黄精供试品溶液，分别按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，并记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积[以黄精碱A色谱峰（22号峰）的出峰时间和峰面积为参照，其他各峰出峰时间和峰面积与其的比值，下同]测得其共有峰相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）均小于3%，表明仪器精密度良好，符合指纹图谱要求。

2.2.4.2稳定性试验取同一批次两蒸黄精供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、8、16、24 h进样，测得其共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%，表明供试溶液在24 h内较稳定，化学成分及含量不会发生变化，符合指纹图谱要求。

2.2.4.3重复性试验取同一批次两蒸黄精水煎液，按“2.2.2”项下平行制备6份供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件分别测定，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%，同一样品每次提取之间的结果比较一致，表明该提取方法重现性良好，符合指纹图谱要求。

2.2.5黄精及不同炮制品水煎液指纹图谱的建立精密吸取各供试品溶液10 μL，分别注入液相色谱仪，进行测定，记录色谱图。取金寨润元生物科技有限公司的同一批生黄精制成黄精不同炮制品各6份，分别测定，各批黄精不同炮制品样品色谱图经过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”处理得到黄精不同炮制品水煎液对照指纹图谱。对照品溶液见图4A，黄精不同炮制品对照图谱见图4B，各共有峰的峰面积见表1。

2.3黄精不同炮制品水煎液糖类成分含量测定

2.3.1色谱条件色谱柱：Shodex Asahipak NH2P-50 4E（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：乙腈（A）∶ 水（B）（75∶ 25，v/v），流速：1.0 mL/min，柱温：30 ℃，进样量：3 μL;检测器：CAD检测器，CAD检测条件：数据采集频率5 Hz，滤光片3.6 F，雾化器温度为35 ℃，气源为N2、压力4.328×105 Pa[3]。在上述色谱条件下，对照品溶液见图5A，各样品的色谱图见图5B。

2.3.2供试品溶液的制备精密移取黄精生品、两蒸、四蒸及九蒸水煎液各2 mL，置具塞锥形瓶中加80%乙醇至30 mL，超声处理60 min（功率500 W，频率30 kHz），过滤，减压回收溶剂，加适量75%乙腈水溶解残渣，定容至150 mL量瓶，0.22 μm微孔滤膜过滤，备用。

2.3.3对照品溶液的制备分别取果糖、D-无水葡萄糖、蔗糖对照品适量，精密称定，置100 mL容量瓶中，加入80%乙醇水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成对照品储备液，其质量浓度分别为0.398 9 mg/mL、0.021 3 mg/mL、0.020 3 mg/mL。

2.3.4方法学考察

2.3.4.1线性关系考察精密量取“2.3.3”项下果糖对照品储备液、葡萄糖对照品储备液、蔗糖对照品储备液不同体积溶液，按“2.3.1”项下色谱条件注入高效液相色谱仪，采用CAD进行分析。以进样量（ X ，μg）为横坐标、峰面积 Y 为纵坐标，绘制标准曲线，最终得到3种成分线性回归方程。见表2。

2.3.4.2精密度试验取同一批次两蒸黄精供试 品溶液分别按“2.3.1”项下色谱条件连续进样6次，记录3种糖的峰面积，各组分峰面积的RSD分别为0.5%、1.3%、0.6%，仪器精密度良好。

2.3.4.3稳定性试验取同一批次两蒸黄精供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、8、16、24 h后进样测定，记录3种糖的峰面积。结果显示，24 h内3种糖的峰面积无明显变化，RSD分别为0.7%、1.4%、0.8%，表明供试品在24 h内稳定性良好。2.3.4.4重复性试验取同一批次两蒸黄精水煎液按“2.3.2”项下平行制备6份供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件分别测定，记录3种糖的峰面积，并计算样品中3种糖的含量。结果3种糖的平均质量分数分别为23.45%、1.15%、3.12%，RSD分别为0.7%、1.8%、1.3%，表明本法重复性良好。

2.3.4.5回收率试验精密移取已知含量的同一批次两蒸黄精水煎液1 mL，置具塞锥形瓶中，平行操作6份，再分别精密加入11.767 8 mg/mL果糖對照品溶液、5.654 5 mg/mL葡萄糖对照品溶液、5.052 3 mg/mL蔗糖对照品溶液各10 mL、1 mL、3 mL，按“2.3.2”项下制备供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件分别测定，计算加样回收率，计算多成分的平均加样回收率分别为98.1%，99.4%，98.7%，RSD值<3.0%。该方法准确可靠。

2.3.5水煎液糖类成分含量测定结果分析精密吸取“2.3.2”项下黄精不同炮制品水煎液供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定黄精不同炮制品水煎液的保留时间以及峰面积，记录色谱图。根据外标法计算多成分的含量。见表3。

2.4黄精不同炮制品水煎液滋阴作用的谱-效关系研究

采用灰色关联度分析方法，分别以皮质酮、肌酐及环核苷酸系统的比值为母序列，黄精不同炮制品水煎液指纹图谱及小分子糖类成分共有峰峰面积为子序列，进行灰色关联度分析。

2.4.1原始数据处理948A108D-8E6F-4CCB-A7D0-9D02CFA49BFF

采用均值法将各原始数据进行无量纲化处理[4]。

2.4.1.1绝对差序列值数据处理后的母序列记作Xo（k），子序列记作Xi（k），绝对差序列值△oi（k）经式1）计算而得。

△oi（k）=|Xo（k）-Xi（k）|…1）

2.4.1.2各比较序列之间关联系数值关联系数值可以反映出被比较序列之间的相关程度。母序列 {Xo（k）}与子序列{Xi（k）}的关联系数值Lo i（k）经式2）计算而得。

Loi（k）=[min min△oi（k）+ρmax max△oi（k）]/[△oi（k）+ρmax max△oi（k）]…2）

min min△oi（k）为二级最小差;max max△oi（k）为二级最大差;ρ为分辨系数，能削弱最大绝对差数值太大引起的数据失真，从而提高关联系数之间的差异显著性，P∈（0，1）。

2.4.1.3关联度值的计算关联度值即各类关联系数之间的平均值。

2.4.1.4求出关联序将各子序列对同一母序列的关联度值按照大小顺序进行排列，即得到各子序列与同一母序列之间的关联度大小顺序。

2.4.2黄精水煎液指纹图谱特征峰与药效作用灰色关联度及关联序依据关联度的大小，确定了各成分对“滋阴作用”贡献的大小顺序。见表4。

由表4可知，各共有峰与滋阴作用的關联度存在较大差异。以滋阴评价指标血清皮质酮为母序列，各共有峰峰面积与滋阴作用之间关联度大于0.75的色谱峰有16、1、36、22、14、37、31号峰。

以滋阴评价指标血清肌酐为母序列，各共有峰峰面积与滋阴作用之间关联度大于0.75的色谱峰有16、1、36、22、14、31、37号峰。

以滋阴评价指标环核苷酸系统的比值为母序列，各共有峰峰面积与滋阴作用之间关联度大于0.75的色谱峰有16、1、36、14、22、31、37号峰。

综合3个评价指标，环磷酸腺苷、环磷酸鸟苷及环核苷酸系统的比值与各共有峰峰面积关联度的分析，结果表明16、1、36、22、14、31、37号色谱峰所代表的化学成分与滋阴作用具有较强的相关性，对滋阴作用贡献较大，其中36号色谱峰为果糖、22号色谱峰为黄精碱A、37号色谱峰为葡萄糖。

3讨论

本实验前期对黄精不同炮制品水煎液进行了滋阴益肾作用的比较，结果表明，黄精生品及不同炮制品均能一定程度改善肾阴虚大鼠症状，其中炮制品的调节作用显著优于生品，表明黄精经炮制后增强了其滋阴益肾的作用，与相关报道一致[5]。

多糖是黄精中的主要药效物质之一，有研究表明，黄精炮制后补益作用增强可能与黄精炮制过程中寡糖成分水解产生小分子糖类成分有关[6]。除多糖成分之外，黄精中还含有皂苷、黄酮以及生物碱类等成分。指纹图谱作为反映药材整体质量的检测方法，在药材质量控制研究当中发挥着重要的作用。本实验通过建立黄精不同炮制品水煎液指纹图谱及小分子糖类成分的含量测定，结合灰色关联分析方法，以期全面反映黄精水煎液中的化学成分与其滋阴药效之间的相互关系。

在对黄精水煎液指纹图谱的研究中发现，以生黄精色谱图作为参照图谱，利用中位数法进行多点校正生成对照图谱，两蒸黄精、四蒸黄精、九蒸黄精与生黄精的相似度分别为0.752、0.579、0.222，表明随着炮制时间的延长，各炮制品与生品的色谱峰差异越来越大;以四蒸黄精色谱图作为参照图谱，利用中位数法进行多点校正生成对照图谱，生黄精、两蒸黄精、九蒸黄精与四蒸黄精的相似度分别为0.579、0.865、0.840，表明黄精在蒸至四蒸时色谱峰已趋于稳定，且炮制后各炮制品的色谱峰丰度和峰面积与生品相比显著增加，可能是黄精炮制品与生品之间具有明显药效差异的原因之一。对黄精水煎液中糖类成分的含量测定发现，各炮制品中的果糖和葡萄糖2种单糖成分含量与生黄精相比差异显著，蔗糖含量随着炮制时间的延长呈现先增加而后消失的现象，可能与炮制过程中多糖大量水解成低聚糖，低聚糖最终水解为单糖有关[7]。

本实验采用灰色关联度分析法，对黄精不同炮制品水煎液指纹图谱及糖类成分共有峰峰面积与滋阴的3个评价指标进行相关性分析，建立了黄精不同炮制品水煎液化学成分与滋阴作用的谱效关系。黄精不同炮制品水煎液中，16、1、36、22、14、31、37号色谱峰所代表的化学成分与滋阴作用具有较强的相关性，对滋阴作用贡献较大，其中36号色谱峰为果糖、22号色谱峰为黄精碱A、37号色谱峰为葡萄糖。王巧莲[8]利用脂多糖诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞建立炎症模型，以NO抑制率为指标，发现黄精碱A化合物的NO抑制率高达83.46%。有研究报道NO在男性的生殖系统功能调节方面具有重要作用[9]，可能为黄精炮制后增强滋阴益肾作用的重要原因之一。果糖和葡萄糖作为多糖水解的产物，在生品和炮制品之间具有显著的差异性，且与黄精滋阴药效之间也具有一定的相关性，能一定程度上反映黄精不同炮制品的药效强度。2020年版《中华人民共和国药典》和各省市炮制规范中黄精及其炮制品饮片均以多糖作为含量测定指标，缺乏专属性质控成分，难以保证黄精炮制品的质量和临床疗效[10]。因此，可考虑用含量及药效关联度均较高的果糖和黄精碱A成分作为黄精炮制品的含量测定指标，从而完善黄精饮片的质量评价体系。

参考文献

[1] 任洪民，邓亚羚，张金莲，等.药用黄精炮制的历史沿革、化学成分及药理作用研究进展[J].中国中药杂志，2020，45（17）：4163-4182.

[2]范顺明，张春玲，罗婷，等.知母-黄柏药对盐炙前后对肾阴虚大鼠滋阴清热作用的影响[J].中药新药与临床药理，2020，31（10）：1141-1146.

[3]郑晓倩，金传山，张亚中，等.黄精九蒸九晒炮制过程中糖类成分动态变化[J].中成药，2020，42（7）：1837-1841.

[4]朱诗塔，雷鹏，李新中，等.掌叶大黄不同炮制品指纹图谱与其止血作用的灰关联度分析[J].中南药学，2009，7（1）：55-58.

[5]林雨.滇黄精炮制前后对肺、肾阴虚小鼠的改善作用及机制研究[D].昆明：昆明理工大学，2021.

[6]张艳雪，周巧，张学兰，等.黄精炮制前后寡糖与单糖类成分含量变化与转化机制研究[J].中药材，2020，43（2）：318-322.

[7]左雅敏，李琛，彭兴春，等.HPLC-一测多评法测定黄精及其饮片中6种成分的含量[J].中国药房，2019，30（13）：1748-1754.

[8]王巧莲.黄精根茎化学成分及其抗炎活性研究[D].北京：北京化工大学，2016.

[9]凌庆枝，高莉莉，敖宗华，等.六味地黄汤对肾阴虚型生精障碍大鼠生殖系统的影响[J].中成药，2009，31（5）：688-691.

[10] 刁卓，刘军玲，胡冲，等.基于酒黄精炮制前后糖类成分的变化探讨《中国药典》酒黄精含量测定指标的合理性[J].中国药事，2022，36（1）：56-65.

（2022-03-10收稿本文编辑：吴珊）

基金项目：国家重点研发计划项目（2018YFC1707200）;安徽省高等学校自然科学研究项目（KJ2020A0421）;六安市产学研合作重大专项（六科[2019]19）作者简介：余欢迎（1995.10—），男，硕士研究生在读，研究方向：中药炮制与中药饮片质量，E-mail：2920397916@qq.com通信作者：金传山（1963.07—），男，本科，硕士研究生，教授，硕士研究生导师，研究方向：中药炮制与中药饮片质量，E-mail：jcs4@sohu.com948A108D-8E6F-4CCB-A7D0-9D02CFA49BFF