孙 伟，白 剑，李凤岩，苗 健，苗兰英

(1.朝阳市第二医院胃肠外科，辽宁 朝阳 122000；2.辽宁中医药大学，沈阳 110847；3.大连医科大学附属第二医院，大连 116021)

大肠癌是一种高发的消化道肿瘤，临床上的治疗方案以手术切除配合放化疗为主，如病情严重则以主张通过化疗提高患者的生活质量，延长生存期[1]。甘草次酸(glycyrrhetinic acid,GA)属五环三萜类化合物，其药理学活性广泛，包括抗炎、抗病毒、抗肿瘤和抑制细菌生长等[2]。有研究显示GA在体外可以有效的抑制甲状腺癌细胞的增殖，其机制与抑制AKT/NF-κB信号通路活性有关[3]。核转录因子κB(nuclear factor Kappa-light-chain-enhancer of activated B cells,NF-κB)的异常表达与多种疾病如大肠癌的发生密切相关。炎症细胞释放的趋化因子和细胞因子可以上调NF-κB在炎症组织中的表达，而NF-κB的上调可以增加肿瘤细胞逃避免疫监视的能力[4]。在小鼠的肠癌模型中也发现降低肠上皮中的NF-kB表达可以明显抑制消化道肿瘤的生长[5]。因此，本研究通过观察GA在体外对大肠癌LoVo细胞的增殖和侵袭的影响，分析其可能作用途径，为临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

甘草次酸购买于梯希爱(上海)化成工业发展有限公司(产品标号：S0988,HPLC≥98%)；四氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)、TRIzol和5氟尿嘧啶(5 fluorouracil,5-FU) (产品标号：F6627-5G,HPLC≥99%)购买于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；大肠癌LoVo细胞株购买于上海碧云天生物技术有限公司(产品标号：C6519)；DMEM/F-12培养基和胎牛血清购自GBICO公司；Transwell(型号3422)小室培养板购买于美国康宁公司；Annexin V/PI AAD细胞凋亡检测试剂盒买于美国BD公司；α-Tubulin(产品编号：sc-8035)和NF-kB p-P65(产品编号：sc-8008)抗体购买于Santa Cruz公司；分析纯试剂购买于国药集团北京分公司；；FACSCalibur流式细胞仪购买于美国BD公司；二氧化碳培养箱购买于美国Thermo公司；550酶标仪和垂直系列电泳仪购买于美国伯乐公司。

1.2 大肠癌LoVo细胞培养和分组[3,6]

将大肠癌LoVo细胞接种在含10%胎牛血清的DMEM/F-12中培养，当细胞融合度达到90%后，将细胞用0.5%胰酶消化后，接种于6孔板和96孔板内。在细胞融合度达到70%后将细胞分为对照组，GA低、中、高剂量组和5-FU组，每组设置6个复孔。其中对照组为不含有血清的DMEM/F-12培养基，GA低、中、高剂量组中GA的浓度分别为50,100,200 μmol/L，5-FU组为浓度100 μmol/L的5-FU。在分组后的细胞继续培养24 h和48 h后进行相关的检测。

1.3 大肠癌LoVo细胞增殖的检测

将接种于96孔板的细胞用PBS冲洗2次后，加入MTT溶液孵育30 min，用移液器移除液体后，在每孔中加入100 μl的二甲基亚砜，在振荡仪上摇匀10 min。酶标仪在光波长570 nm 处检测光密度值。细胞增殖率( %) = 干预组光密度值) /对照组光密度值× 100%。

1.4 大肠癌LoVo细胞凋亡的检测

将经过分组并药物孵育的大肠癌LoVo细胞从96孔板消化后分别收集到离心管内，用PBS冲洗后在1 100 r/min下离心3 min，重复上述冲洗过程一次。将经过洗涤后的细胞收集到离心管中，在避光条件下按照Annexin V/PI凋亡检测试剂盒说明书操作，并通过流式细胞仪检测细胞的凋亡率。

1.5 大肠癌LoVo细胞的侵袭能力的检测

将接种于六孔板的大肠癌LoVo细胞消化后用DMEM/F-12重悬细胞，将细胞浓度调整为5×105cells/ml，在每个Transwell小室中加入0.2 ml的细胞混悬液，之后在每孔中加入1 ml不含血清的对照组，GA低、中、高剂量组和5-FU组的培养基，每组设置6个复孔，继续在培养箱中培养24 h。带培养完毕后，在每孔中加入0.5 ml结晶紫溶液孵育30 min对细胞染色，在显微镜下计数。

1.6 大肠癌LoVo细胞中蛋白质NF-κB的检测

将在6孔板内培养48 h各组大肠癌LoVo细胞用PBS清洗后，加入Trizol裂解，将裂解后的液体收集到1.5 ml EP管中，煮沸5 min使蛋白质变性，在 12 000 r/min低温离心机中离心1 min。使用BCA法对蛋白定量，向SDS-PAGE凝胶中加各组蛋白样品，转PVDF 膜。使用5%脱脂奶粉封闭样品后，加入稀释后的一抗NF-κB p-P65 (1∶1 000)和α-Tubulin (1∶1 000)，4℃孵育过夜后，加入二抗在37℃孵育1 h，DAB显色。通过条带的灰度值确定蛋白质的表达水平。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 GA对大肠LoVo细胞增值的影响

经过GA和5-FU 孵育12 h后，与对照组相比，5-FU组中的细胞增殖率显著低于对照组(P<0.05)；经过GA和5-FU 孵育24 h和48 h后，与对照组相比，GA的中、高剂量组和5-FU组中的细胞增殖率均显著低于对照组(P<0.05，表1)

Tab. 1 Effects of different concentrations ofglycyrrhetinic acid on the ratio of proliferation in colorectal cancer LoVo (%， n=6)

2.2 GA对大肠LoVo细胞凋亡的影响

各组细胞经过GA和5-FU孵育48 h后，与对照组相比，GA中、高剂量组和5-FU组的G0/G1期细胞比例明显高于对照组 (P<0.05)；与对照组相比，GA低、中、高剂量组和5-FU组的G2/M期细胞比例明显低于对照组的细胞 (P<0.05，表2)

Tab. 2 Effects of different concentrations of glycyrrhetinic acid on the ratio of apoptosis in Colorectal cancer LoVo after 48 hours of incubation (%， n=6)

2.3 GA对大肠LoVo细胞侵袭能力的影响

各组细胞经过GA和5-FU孵育48 h后，与对照组相比，GA低、中、高剂量组和5-FU组的细胞计数明显低于对照组(P<0.05)。

2.4 GA大肠LoVo细胞中蛋白质NF-κB增殖的影响

各组细胞经过GA和5-FU孵育48 h后，浓度为100 μmol/L和200 μmol/L GA组中NF-κB蛋白表达的相对量为分别为(2.28±0.46)和(1.91±0.11)，与对照组(3.31±0.45)相比有显著性差异(P<0.05)，且NF-κB的表达随着GA浓度增加而逐渐减弱，呈现剂量依赖性(图1)。

Fig. 1 Expression of NF-κB proteins after colorectal cancer LoVo cells were incubated with different concentrations of glycyrrhetinic acid for 48 h

3 讨论

NF-κB中一类关键性的核转录因子，通常以同源或异源二聚体非活性形式存在于几乎所有类型细胞的胞质中，NF-κB核转录因子参与炎症、肿瘤、细胞生长和免疫反应等多种疾病的发展过程，而大肠癌的转移和复发与NF-κB的表达密切相关[4]。有研究报道，NF-κB可以帮助大肠癌逃避机体的免疫监视，造成肿瘤的远处转移，如果抑制NF-κB的表达可以诱导大肠癌细胞凋亡[7，8]。许多凋亡相关的调节蛋白如p53、TRAIL、Caspase、Survivin、COX-2等均受到NF-κB信号通路的调控[9]。因此，如果能有效的抑制NF-κB的表达，就可以促进肿瘤细胞进入凋亡途径，并最终减少肿瘤复发和转移。

大肠癌在中医术语“肠覃”和“积聚”的范畴，肠覃乃寒气客于大肠，湿毒瘀滞，积聚与腹，宜选用益气固本、清热解毒的治疗方法[10]。甘草是传统中草药，具有补脾益气、解毒缓急的功效。GA作为甘草水解后的有效成分之一具有明确抗肿瘤作用，对GA体外治疗敏感的肿瘤包括胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、胰腺癌、食管癌和部分血液肿瘤[11，12]。本室前期的研究发现[3]，GA在体外浓度达到100 μmol/L就可有效的抑制甲状腺癌细胞的增殖，抑制效果随着药物作用的时间和浓度的增加呈现一定的时间和剂量依赖性。因此，本次实验在选取浓度为100 μmol/L的GA作为中浓度并进一步观察药物-剂量的关系。通过大肠癌LoVo细胞凋亡的检测发现低浓度的GA能够明显增加G0/G1期的细胞数量，G2/M期的数量显著降低，提示GA可以把大肠癌细胞阻滞在G0/G1期。有研究显示cyclin D1蛋白作为细胞周期调节蛋白在G1期起重要调节作用，其在大肠癌组织中均有不同程度的过度表达，而在对不同类型肿瘤的研究发现，GA可以通过抑制cyclin D1的表达实现对大肠癌细胞增殖的抑制作用[13,14]。由此可见，GA对大肠癌细胞增殖的抑制作用和细胞周期的影响可能与GA通过抑制cyclin D1的表达有关。有研究显示GA可以通过PI3K-Akt-mTOR通路和NF-κB通路抑制胃癌细胞SGC7901 增殖[11]，通过抑制NF-κB的表达降低肿瘤的转移和侵袭能力。在本次实验中GA可以抑制大肠癌细胞中NF-κB的表达，随着GA浓度逐渐升高，NF-κB蛋白的表达逐渐减弱，二者呈现剂量依赖性关系[4]。

综上所述，本次研究发现浓度为100 μmol/L 的GA能抑制大肠癌细胞增殖，其机制可能与抑制NF-κB信号通路有关，对于临床的治疗效果尚有待观察。