王兴瑞，韩玉泽，李应霞，王淑珍，陈昀昀，王进英,2

(1.青海大学 农牧学院，西宁810016； 2.青海大学 三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，西宁810016)

亚麻，是我国重要的经济作物，主要分布在我国西北和华北北部干旱、半干旱地区[1]。其中，青海省亚麻种植历史悠久，其特有的高原地理和气候特征使得亚麻成为青海省一种具有栽培价值的油料作物。亚麻籽油是以油用亚麻为原料制备的一种干性油[2]，油中α-亚麻酸含量可达50%～60%[3]。α-亚麻酸是维持机体正常生理功能和生长发育的必需脂肪酸[4]，具有提高免疫力、降血压、降血脂、预防心脑血管疾病等功能[5]。因此，亚麻籽油具有很好的市场前景。

由于亚麻籽油优越的营养价值和经济价值，其掺伪现象时有发生。目前，对植物油掺伪识别主要是通过测定植物油中的脂肪酸、甾醇、挥发性组分等成分来完成。但是，对于植物油中脂肪酸和甾醇等成分的测定并不能完全区分植物油的类别[6]。甘三酯(TAG)是植物油中的主要成分，且每种类型的植物油都有其特有的TAG特征[7]，所以对植物油TAG的测定可为植物油质量控制和掺伪识别提供参考[8]。

目前对于植物油TAG的检测方法主要有气相色谱法和液相色谱法[9]，但气相色谱法需要在高温(>350℃)条件下进行，高温环境可能导致色谱柱劣化和TAG降解[10]，还不容易确定TAG的异构体结构和双键数目[11]，影响检测效果。液相色谱法则适用于大多数非挥发性成分的测定，根据各脂肪酸链长和不饱和度的不同，进而实现对单个TAG分子的分离[9]。对于液相色谱法检测TAG，折光率检测器常用于常规和等度分析[12]；紫外检测器在极低波长(205～210 nm)下显示出良好的线性响应[13]，但对饱和TAG的检测灵敏度较低；与高效液相色谱-紫外检测器相比，蒸发光散射检测器(ELSD)灵敏度更高，适用性更好[14]。近年来，HPLC-ELSD法被广泛应用于植物油TAG组分的测定。Marwa等[15]利用HPLC-ELSD法建立了特级初榨橄榄油TAG指纹图谱，可实现对橄榄油品种和成熟度的鉴别；Zhang等[14]用HPLC-ELSD法测定了杜仲籽油的TAG含量；皇甫志鹏等[16]利用HPLC-ELSD法建立了纯芝麻油的TAG指纹图谱数据库，可对掺伪大豆油和葵花籽油比例达到3%的芝麻油做出准确的判定。

本研究以青海省亚麻籽油为研究对象，利用HPLC-ELSD法测定分析了青海亚麻籽油中TAG组成分布情况，构建了亚麻籽油TAG指纹图谱，利用指纹图谱对亚麻籽油进行掺伪识别，旨在开发一种快速、简便的亚麻籽油掺伪检测方法，为青海省亚麻籽油的质量监控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

40种青海亚麻籽样品信息见表1；大豆油、玉米油、菜籽油、花生油、葵花籽油、芝麻油，购于京东广生林食品专营店。色谱纯异丙醇、色谱纯乙腈，美国天地试剂公司。

表1 40种青海亚麻籽样品信息

1.1.2 仪器与设备

Shimadzu LC-20AD高效液相色谱仪(配备有CMB-20A控制器、LC-20AD二元泵、SIL-20A 自动进样器和CTO-10AS柱温箱)，日本Shimadzu公司；2000ES-蒸发光散射检测器，美国奥泰科技(中国)有限公司；ZORBAX SB-C18分析型色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，美国Agilent公司；XW-80A涡旋混合器；FA2004B电子天平。

1.2 试验方法

1.2.1 亚麻籽油的制备

亚麻籽清理、分拣、粉碎后得到亚麻籽粉，利用索氏抽提法(提取溶剂为石油醚，料液比0.06∶1，提取温度70℃，提取时间8 h)提取亚麻籽油，低温旋蒸除去石油醚后备用。40种亚麻籽QH-1～QH-40制备的亚麻籽油对应编号为S1～S40。

1.2.2 HPLC-ELSD法分析亚麻籽油中TAG组成

1.2.2.1 样品制备

精确称取(50.0±0.1)mg亚麻籽油，用异丙醇充分涡旋混匀溶解后，定容于10 mL容量瓶中。样品经0.45 μm滤膜过滤后，进样分析。

1.2.2.2 HPLC-ELSD法测定条件

参照王进英等[17]测定油茶籽油甘三酯组成的方法，并对梯度洗脱程序进行优化，最终色谱条件为：ZORBAX SB-C18分析型色谱柱(4.6 mm ×250 mm, 5 μm)；柱温25℃；流动相A为乙腈，流动相B为异丙醇，流动相梯度洗脱程序见表2；流速0.8 mL/min，进样量10 μL；漂移管温度80℃；空气流速2.8 L/min；增益1。

表2 流动相梯度洗脱程序

1.2.3 方法学考察

1.2.3.1 精密度试验

取同一种亚麻籽油(S1)，按照1.2.2.1的方法进行处理，连续进样分析6次，计算亚麻籽油中各TAG组分峰面积的相对标准偏差(RSD)和保留时间的RSD。

1.2.3.2 重复性试验

取同一种亚麻籽油(S1)，按照1.2.2.1的方法制备6份样品进样分析，计算亚麻籽油中各TAG组分峰面积的RSD。

1.2.3.3 稳定性试验

取同一种亚麻籽油(S1)，按照1.2.2.1的方法进行处理后，在室温下放置0、2、4、8、12、24 h后进样分析，计算亚麻籽油中各TAG组分峰面积的RSD。

1.2.4 青海亚麻籽油TAG指纹图谱的构建

将40种亚麻籽油样品按1.2.2方法进行分析，得到S1～S40共40个原始图谱。利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004 A)，设立参照图谱，经多点校正、自动匹配，得到亚麻籽油TAG标准指纹图谱。

1.2.5 掺伪模型建立

按大豆油、玉米油、菜籽油、花生油、葵花籽油和芝麻油，质量分数分别为5%、10%、20%、30%、40%、50%，将其与亚麻籽油混合，按照1.2.2.1的方法制备样品，建立掺伪模型。

1.2.6 数据处理及统计

所有数据平行测定3次，结果取平均值，采用Microsoft Excel 2010和SPSS 22.0软件对数据进行统计分析，Origin 2018作图。

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化

亚麻籽油TAG在不同梯度洗脱条件下的液相色谱图见图1。由图1可以看出，优化前亚麻籽油中TAG组分出峰时间主要集中在5～20 min，优化后的洗脱程序可以对色谱峰实现更好的分离，分析时间缩短至50 min，同时大大节省了试剂用量。

图1 亚麻籽油TAG在不同梯度洗脱条件下的液相色谱图

2.2 7种植物油TAG的定性、定量分析

2.2.1 定性分析

在相同色谱条件下，分析大豆油、玉米油、菜籽油、花生油、葵花籽油、芝麻油6种植物油的TAG组成。基于TAG按照ECN数(ECN=CN(碳原子数)-2DN(双键数目))由小到大分离的规律[17]，7种植物油TAG的液相色谱图如图2所示。由图2可知：菜籽油中峰7峰面积最大，根据安广杰[18]、Yasushi[19]等对菜籽油中TAG组分的研究，OOO(ECN=48,O为油酸)是菜籽油中含量最高的TAG组分(分别占比34.99%和28.7%)，故将保留时间为19.45 min的峰7定性为ECN48分区；大豆油、玉米油和葵花籽油中峰5a峰面积最大，根据Salghi等[20]对大豆油、Zhang等[21]对玉米油和Sara等[22]对葵花籽油中TAG组分的研究，LLO(ECN=44，L为亚油酸)是其最主要的TAG组分，故将14.61 min出现的峰5a定性为ECN44分区；芝麻油在16.83 min出现的峰6a峰面积最大，根据皇甫志鹏[16]、Sara[22]等的研究，OOL(ECN=46)是其最主要的TAG组分(分别占比31.43%、17.43%)，故将此峰定性为ECN46分区;结合文献[23-25,7]的研究，将12.76 min出现的峰4a定性为LLL(ECN42分区)；再结合文献[26，27-30]对亚麻籽油中TAG含量分布的研究，可以推断亚麻籽油中峰1为LnLnLn(ECN36，Ln为亚麻酸)，峰2为LLnLn(ECN38)，峰3为OLnLn(ECN40)，峰4b为OLLn(ECN42)，峰5b为OLnO(ECN44)，峰6b为SOLn(ECN46，S为硬脂酸)，峰7为OOO(ECN48)，峰8为POO(ECN48，P为棕榈酸)。

图2 7种植物油TAG的液相色谱图

2.2.2 定量分析

采用峰面积归一化法对青海不同产地亚麻籽油TAG组分进行定量分析，结果见表3。

表3 青海不同产地亚麻籽油TAG含量分布情况

由表3可知，青海省四个产区亚麻籽油中各TAG含量差异不显著(P>0.05)，但相同产区亚麻籽油中各TAG组分有显著差异(P<0.05)。不同ECN分区中ECN40分区的相对含量最高，平均为 29.40%(P<0.05)；其次是ECN36，平均为23.71%(P<0.05)；在ECN38、ECN42、ECN44分区中，其TAG含量相近。TAG含量大小顺序为OLnLn(29.40%)>LnLnLn(23.71%)>OLnO(15.10%)>OLLn(13.43%)>LLnLn(13.32%)>SOLn(2.84%)>OOO(1.56%)>POO(0.18%)。由此可得，青海亚麻籽油TAG组分主要是以亚麻酸(Ln)、油酸(O)、亚油酸(L)为主的长碳链型不饱和脂肪酸甘三酯，这与杨青坪[26]对亚麻籽油TAG组分研究的结论一致。另外，对比本实验室对青海亚麻籽油脂肪酸含量的测定结果(亚麻酸(Ln)42.14～60.39 g/100 g，油酸(O)12.45～26.14 g/100 g，亚油酸(L)10.30～15.04 g/100 g，棕榈酸(P)4.13～5.54 g/100 g，硬脂酸(S)2.62～5.09 g/100 g)，发现各TAG含量与脂肪酸含量基本吻合，脂肪酸含量影响TAG含量。

亚麻籽油与6种用于构建掺伪模型的植物油之间的TAG含量分布情况见表4。由表4可知，亚麻籽油的TAG组成与6种掺伪植物油的TAG组成有较大差异，6种植物油TAG主要集中在ECN42～48(LLL、LLO、OOL、OOO)分区，而亚麻籽油中TAG主要为ECN40和ECN36。亚麻籽油中LnLnLn、LLnLn、OLnLn、OLLn含量与其他6种植物油的差异显著(P<0.05)，亚麻籽油独特的TAG组成也为亚麻籽油掺伪识别提供了可能性。

表4 7种植物油的TAG含量分布情况

2.3.1 精密度试验

试验表明，LnLnLn、LLnLn、OLnLn、OLLn、OLnO、SOLn、OOO、POO的峰面积RSD分别为0.16%、0.23%、0.09%、0.11%、0.21%、0.30%、0.11%、0.21%，保留时间RSD分别为0.04%、0.04%、0.05%、0.07%、0.09%、0.12%、0.15%、0.21%，说明精密度良好。

2.3.2 重复性试验

试验表明，LnLnLn、LLnLn、OLnLn、OLLn、OLnO、SOLn、OOO、POO的峰面积RSD分别为1.15%、1.21%、1.30%、1.67%、0.93%、1.37%、1.67%、1.41%，说明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验

试验表明，LnLnLn、LLnLn、OLnLn、OLLn、OLnO、SOLn、OOO、POO的24 h内峰面积RSD分别为0.31%、0.61%、0.20%、0.09%、0.13%、0.79%、0.18%、0.20%，说明样品制备后24 h内稳定性良好。

2.4 青海亚麻籽油TAG指纹图谱的构建

按照1.2.4的方法，得到亚麻籽油S1～S40的原始液相色谱图和亚麻籽油TAG的标准指纹图谱，分别如图3、图4所示。

指纹图谱的相似度表明指纹图谱的整体相关性，计算各油样的相似度可以对油样进行更系统的评定[31]。将亚麻籽油标准指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004 A)，对比40种亚麻籽油TAG液相色谱图，其相似度均大于0.98，表明构建的标准指纹图谱符合指纹图谱研究的技术要求[32]，可以在一定程度上代表青海亚麻籽油样品的整体性。

注：图中由下至上为亚麻籽油S1～S40。

注：1.LnLnLn；2.LLnLn；3.OLnLn；4.OLLn；5.OLnO；6.SOLn； 7.OOO； 8.POO。

2.5 TAG指纹图谱在青海亚麻籽油掺伪识别中的应用

比较1.2.5中建立的6种植物油掺伪模型液相色谱图与亚麻籽油TAG标准指纹图谱的相似度，对掺伪比例和相似度进行二项式拟合，结果见表5。

表5 各掺伪模型与指纹图谱相似度的二项式拟合方程

由表5可知，6种植物油掺伪模型二项式拟合方程R2均大于0.98，呈现良好的相关性，理论上可以应用于5%～50%掺伪量的掺伪识别。根据各掺伪模型与指纹图谱的相似度，利用各二项式拟合模型计算掺伪量，对比真实掺伪量，求得相对误差，掺伪模型与指纹图谱相似度及相对误差见表6。

表6 掺伪模型与指纹图谱的相似度及相对误差 %

由表6可知：本指纹图谱对掺入5%～50%大豆油、玉米油、菜籽油(掺伪量10%～50%)、花生油、葵花籽油和芝麻油的亚麻籽油鉴别平均相对误差分别为0.37%、1.21%、0.29%、2.25%、1.05%、1.46%，均处于较低水平。大豆油掺伪量为5%～50%时识别度均处于较高水平(Re≤0.70%)；芝麻油和葵花籽油次之(Re≤2.75%、Re≤2.90%)；花生油掺伪量为10%时相对误差较高(Re=9.15%)；菜籽油掺伪量为5%时超出了拟合方程的计算范围，未能实现鉴别。

综上，本试验构建的亚麻籽油甘三酯指纹图谱在掺伪量5%～50%时，最适合价格相对最低的掺伪大豆油的鉴别，能达到精准鉴别；对掺伪葵花籽油和芝麻油的鉴别也处于较高水平；但本指纹图谱不适合掺伪量5%菜籽油的鉴别；对掺伪量为10%花生油的鉴别也可能存在较大误差。

3 结 论

本研究利用HPLC-ELSD法测定了青海亚麻籽油中TAG组成及含量，运用中药色谱指纹图谱相似度评价系统构建了TAG标准指纹图谱，并运用该指纹图谱识别了6种掺伪量为5%～50%的掺伪模型。结果表明：该指纹图谱可对掺入5%～50%大豆油、玉米油、葵花籽油、芝麻油的亚麻籽油进行识别，其中：对价格相对最为低廉的大豆油鉴别效果最好；对花生油掺伪量10%的掺伪模型鉴别误差较大，相对误差为9.15%；对于掺伪量5%的菜籽油掺伪模型未能识别，但可准确识别掺伪量10%～50%掺伪模型。研究结果可为青海省亚麻籽油品质控制和掺伪识别提供理论依据。