文建庭 刘健 姜辉 孙艳秋 王馨 王杰 周琴 丁香 陈晓露 张先恒

【摘 要】目的：探究佐剂性关节炎（AA）大鼠外周血单个核细胞（PBMCs）中人微小RNAs（hsa-miRNAs）的表达及新风胶囊（XFC）干预研究。方法：建立AA大鼠模型，造模后第12天开始给药，将大鼠随机分为正常组（NC组）、模型组（MC组）、XFC低剂量组（L-XFC组）、XFC中剂量组（M-XFC组）、XFC高剂量组（H-XFC组）。给药30 d后，观察各组大鼠体质量、足跖肿胀度、关节炎指数（AI）的变化；RT-qPCR法检测PBMCs中miRNAs的表达；ELISA法检测血清中C反应蛋白（CRP）、抗环瓜氨酸肽抗体（抗CCP抗体）、类风湿因子（RF）、白细胞介素（IL）-11、IL-17、IL-4、IL-10的表达。结果：①致炎前，各组大鼠体质量、足跖肿胀度及AI比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；致炎12 d，各组大鼠足跖肿胀度和AI均显著升高（P < 0.01）；XFC给药后，各组大鼠体质量、足跖肿胀度、AI得到显著改善。②与NC组相比，MC组hsa-miR-146a-3p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-597-3p mRNA表达显著降低（P < 0.01），CRP、RF、抗CCP抗体、IL-17、hsa-miR-3184-5p mRNA表达显著升高（P < 0.01）；XFC治疗后，上述指标得到显著改善。③Spearman相关性分析结果显示，hsa-miR-146a-3p与足跖肿胀度、CRP、RF、IL-11呈显著负相关，与IL-4呈显著正相关（P < 0.05）；hsa-miR-31-5p与AI、RF、IL-17呈负相关，与IL-10呈正相关（P < 0.05）；hsa-miR-29c-3p与RF、IL-11呈负相关（P < 0.05）；hsa-miR-3184-5p与IL-4呈负相关（P < 0.05）。结论：AA大鼠PBMCs中存在差异表达的hsa-miRNAs，与免疫炎症指标具有显著相关性，XFC在改善免疫炎症指标的同时，也能改善miRNAs，其机制有待进一步研究。

【关键词】 类风湿关节炎；佐剂性关节炎；微小RNAs；新风胶囊；干预研究；大鼠

Expression of hsa-miRNAs in Peripheral Blood Mononuclear Cells of Adjuvant Arthritis Rats and Intervention of Xinfeng Capsule（新風胶囊）

WEN Jian-ting，LIU Jian，JIANG Hui，SUN Yan-qiu，WANG Xin，WANG Jie，ZHOU Qin，DING Xiang，CHEN Xiao-lu，ZHANG Xian-heng

【ABSTRACT】Objective：To investigate the expression of hsa-miRNAs in peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）of adjuvant arthritis（AA）rats and the intervention of Xinfeng Capsule（新风胶囊，XFC）.Methods：The AA rat model was established，and the drug was administered on the 12 th day after the model was established.

The rats were randomly divided into a normal group（NC group），a model group（MC group），a low-dose XFC group（L-XFC group），a medium-dose XFC group（M-XFC group），and a high-dose XFC group（H-XFC group）.After 30 days of administration，the changes of body mass，footpad swelling，and arthritis index（AI）of the rats in each group were observed.The expression of miRNAs in PBMCs was detected by RT-qPCR.The expressions of CRP，anti CCP antibody，RF，interleukin IL-11，IL-17，IL-4 and IL-10 in serum were detected by ELISA.Results：①There was no significant difference（P > 0.05）in body mass，footpad swelling and AI of rats in each group before inflammation;twelve days after inflammation，the degree of footpad swelling and AI of rats in each group increased significantly（P < 0.01）;After administration of XFC，body mass，footpad swelling and AI were significantly improved.②Compared with the NC group，the expressions of hsa-miR-146a-3p，hsa-miR-31-5p，hsa-miR-29c-3p，and hsa-miR-597-3p mRNA in the MC group decreased significantly（P < 0.01），while the expressions of CRP，RF，anti CCP antibody，IL-17，hsa-miR-3184-5p mRNA in the MC group increased significantly（P < 0.01）;After treatment with XFC，the above indicators were significantly improved.③Spearman correlation analysis showed that hsa-miR-146a-3p was significantly negatively correlated with footpad swelling，CRP，RF and IL-11，and significantly positively correlated with IL-4（P < 0.05）;hsa-miR-31-5p was negatively correlated with AI，RF，IL-17，and positively correlated with IL-10（P < 0.05）;hsa-miR-29c-3p was negatively correlated with RF and IL-11（P < 0.05）;and there was a negative correlation between hsa-miR-3184-5p and IL-4（P < 0.05）.Conclusion：There are hsa-miRNAs differentially expressed in PBMCs of AA rats，which are significantly correlated with immune inflammatory indicators.XFC can improve both immune inflammatory indicators and miRNAs，and its mechanism needs further study.

【Keywords】 rheumatoid arthritis;adjuvant arthritis;micro RNAs;Xinfeng Capsule（新风胶囊）;intervention study;rats

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以骨和关节软骨进行性破坏为特征的慢性炎症性疾病，发病率高、致残率高，以滑膜炎和血管炎为主要病理表现［1-2］。微小RNAs（miRNAs）是一类单链内源性非编码小RNAs，长度约为21～

25个核苷酸，通过发挥调控基因表达、细胞生长、分化及凋亡等在RA中发挥重要作用［3-4］。目前研究發现，RA患者血清、外周血单个核细胞（PBMCs）、滑膜细胞等均有差异表达的miRNAs［5］。miRNAs的多靶点、多环节作用机制提示其可能在RA复杂病机中起关键作用。已有多种异常表达的miRNAs如miR-155、miR-125a等通过影响下游靶基因参与RA炎症免疫反应、凋亡逃逸及氧化应激等发病机制［6-7］。RA属中医学“痹证”范畴，脾虚湿盛是其重要病机，中药复方新风胶囊（XFC，专利号ZL201310011369.8）在新安医学理论指导下创制，具有健脾化湿通络作用，应用于临床20余年，疗效显著［8-9］。

本团队前期通过高通量测序得到RA患者PBMCs中差异表达的miRNAs［10-11］，为比较不同种属差异miRNAs表达的一致性，探寻RA相关的特征性miRNAs，进行病毒载体介导的动物体内基因转染实验及XFC的作用机制。本研究通过复制佐剂性关节炎（AA）大鼠模型，观察AA大鼠PBMCs中人微小RNAs（hsa-miRNAs）的表达及XFC的干预作用。

1 实验材料

1.1 实验动物 雄性清洁级SD大鼠50只，体质量（180±20）g；购自安徽省实验动物中心，动物使用许可证号SYXK（皖）2005-02，安徽中医药大学标准清洁级实验动物房喂养，保持室内环境安静，温度18～22 ℃，相对湿度50%～75%，保持通风排气每小时10～20次。

1.2 药品及试剂 XFC每粒含生药0.4 g，购自安徽中医药大学第一附属医院制剂中心，皖药制字Z20050062。弗氏完全佐剂购自Sigma公司；戊巴比妥购自上海雅吉生物科技有限公司；C反应蛋白（CRP）（SU-B30078）、抗环瓜氨酸肽抗体（抗CCP抗体）（SU-B37304）、类风湿因子（RF）（SU-B30575）、白细胞介素（IL）-11（SU-B30195）、IL-17（SU-B30201）、IL-4（SU-B30217）、IL-10（SU-B30194）均购自泉州市睿信生物科技有限公司；逆转录试剂盒购自Thermo Scientific公司；引物由Sangon Biotech合成。

1.3 仪器设备 足跖肿胀测量仪（YLS-7B，上北京吉安得尔科技有限公司）；动物体重天平（上海玉研科学仪器有限公司）；普通PCR仪（PTC-200，伯乐生命医学产品上海有限公司）；高速台式冷冻离心机（LX 300，海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；荧光定量PCR仪（StepOne Plus，美国应用生物系统公司）；酶标分析仪（RT-6100，雷杜公司）。

2 方 法

2.1 造模及给药 50只SD大鼠适应性喂养1周后，随机分为正常组（NC组）10只，AA组40只。

AA组大鼠左后足跖皮内注射弗氏完全佐剂（FCA）0.1 mL，使其致炎复制成AA实验动物模型［12］；造模成功后，第13天将AA组大鼠随机分为4组：模型组（MC组）、XFC低剂量组（L-XFC组）、XFC中剂量组（M-XFC组）、XFC高剂量组（H-XFC组）。第13天开始给药，按照各种实验动物间单位体表面积用药量相等的原则进行药物换算［13］，NC组和MC组：质量分数为0.9%的氯化钠（NaCl），1 mL·（100 g）-1。L-XFC组：将XFC去除胶囊壳，加质量分数为0.9%的NaCl配成混悬液（每毫升含药量0.017 g，即0.17 g·kg-1），1 mL·（100 g）-1灌胃。M-XFC组：将XFC去除胶囊壳，加质量分数为0.9%的NaCl配成混悬液（每毫升含药量0.034 g，即0.34 g·kg-1），1 mL·（100 g）-1灌胃。H-XFC组：将XFC去除胶囊壳，加质量分数为0.9%的NaCl配成混悬液（每毫升含药量0.068 g，即0.68 g·kg-1），1 mL·（100 g）-1灌胃。

2.2 观察指标

2.2.1 体质量、足跖肿胀度和关节炎指数（AI）测算 分别在大鼠造模前1 d、致炎12 d、给药后30 d使用电子天平称量大鼠的体质量，根据大鼠后足跖容积计算足跖肿胀度。分别于造模前1 d和给药后30 d观察和记录全身关节病变程度。大鼠全身关节病变按5级评分法评价，根据未注射FCA的另外3只肢体关节病变程度进行累计积分，计算AI：0分，无红肿；1分，小趾关节红肿；2分，趾关节和足跖肿胀；3分，踝关节以下足爪肿胀。AI为各个关节积分的累计积分，最高为12分。

2.2.2 RT-qPCR检测PBMCs中miRNAs的表达 2％戊巴比妥钠［0.3 mL·（100 g）-1］腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，提取PBMCs，TRIzol提取PBMCs中的总RNA，总RNA按照Thermo反转录试剂盒说明书提供方法进行反转录。PCR反应条件为：95℃预变性30 s，然后进行40个循环反应，每个循环包括95 ℃变性15 s和60 ℃变性30 s。

Bio-Rad凝胶图像分析仪拍照，Image-Pro Plus软件分析，计算电泳条带吸光度值，以U6作为内参，计算mRNA的相对表达量。引物序列见表1。

2.2.3 ELISA法检测CRP、RF、抗CCP抗体及细胞因子的表达 收集各组大鼠血液，置于离心机以3000 r·min-1离心15 min，离心半径10 cm，分离并保存血清，采用ELISA法测定大鼠血清CRP、RF、抗CCP抗体、IL-11、IL-17、IL-4和IL-10的表达量。

2.3 统计学方法 采用SPSS 23.0软件进行统计分析。计量资料以表示，采用正态性检验，单因素方差分析用于多组间比较，相关性分析采用Spearman分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组大鼠体质量、足跖肿胀度和AI的变化及XFC对其影响 致炎前各组大鼠体质量、足跖肿胀度及AI比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。致炎12 d，与NC组比较，各组大鼠体质量差异无统计学意义（P > 0.05），足跖肿胀度和AI均显著升高（P < 0.01）。给药30 d，与NC组比较，MC组大鼠体质量显著降低，足跖肿胀度和AI显著升高（P < 0.01）；与MC组比较，M-XFC组大鼠体质量升高（P < 0.05），其余各组足跖肿胀度和AI显著降低（P < 0.01）。见表2。

3.2 各组大鼠hsa-miRNAs的表达情况 与NC组比较，MC组hsa-miR-146a-3p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-597-3p mRNA表达显著降低（P < 0.01），hsa-miR-3184-5p mRNA表达显著升高（P < 0.01）；与MC组比较，其余各组hsa-miR-146a-3p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-597-3p mRNA表达显著升高（P < 0.05或P < 0.01），hsa-miR-3184-5p mRNA表达显著降低（P < 0.05或P < 0.01）。见表3。

3.3 各组大鼠CRP、RF、抗CCP抗体和细胞因子表达情况 与NC组比较，MC组CRP、RF、抗CCP抗体、IL-17表达显著升高（P < 0.01），IL-4、IL-10、IL-11表达显著降低（P < 0.01）；与MC组比较，各组CRP、RF和抗CCP抗体的表达显著降低（P < 0.01或P < 0.05），M-XFC组和H-XFC组IL-17表达降低，IL-4、IL-10、IL-11表达显著升高（P < 0.05或P < 0.01）。见表4。

3.4 AA大鼠miRNAs与足趾肿胀度、AI、CRP、RF、抗CCP抗体和细胞因子的相关性分析 Spearman相关性分析结果显示，hsa-miR-146a-3p與足跖肿胀度、CRP、RF、IL-11呈显著负相关，与IL-4呈显著正相关（P < 0.05或P < 0.01）；hsa-miR-31-5p与AI、RF、IL-17呈负相关，与IL-10呈显著正相关（P < 0.05或P < 0.01）；hsa-miR-29c-3p与RF、IL-11呈显著负相关（P < 0.05或P < 0.01）；hsa-miR-3184-5p与IL-4呈显著负相关（P < 0.05）。见表5。

4 讨 论

miRNAs具有多种功能，可以通过调控靶基因参与RA的发病，包括滑膜增殖、炎症反应、血管翳形成、骨流失及骨破坏等病理反应［14］。ZHOU等［15］发现，miR-27b直接抑制HIPK2表达，介导软骨细胞凋亡，改善RA的发展。WEI等［16］研究表明，miR-101-3p通过下调PTGS2来减轻AA大鼠的足跖关节和RF。因此，发现RA的特征性miRNAs，系统研究其在RA发病机制中的多环节、多靶点作用具有重要意义。本研究通过复制AA大鼠模型，观察发现给予FCA致炎后，大鼠足跖出现红肿、局部焮热症状，致炎12 d，与NC组比较，各组大鼠足跖肿胀度和AI均显著升高，说明模型复制成功。RT-qPCR结果显示，与NC组比较，MC组hsa-miR-146a-3p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-597-3p mRNA表达显著降低，hsa-miR-3184-5p mRNA表达显著升高，说明hsa-miRNAs在RA患者和AA大鼠体内具有同源性表达。另外，运用ELISA法检测大鼠血清中免疫炎症指标的表达，结果显示，与NC组比较，MC组CRP、RF、抗CCP抗体、IL-17表达显著升高，IL-4、IL-10、IL-11表达显著降低。相关性分析结果显示，大鼠体内差异表达的miRNAs与免疫炎症指标具有显著相关性。有研究表明，miR-16、miR-17等6种miRNAs在RA患者血浆、PBMC及关节液中有显著变化，且与RA疾病活动性指标ESR、CRP、RF等密切相关［17］。与本研究结果类似，均表明miRNAs表达水平可作为RA疾病活动的有效检测指标，可协助RA临床诊断。

RA属中医学“痹病”范畴，中医药治疗RA历史悠久，疗效显著，既可抗炎止痛、缓解症状以治标，又可改善微循环、调节免疫以固本，达到标本兼治的目的。中药复方XFC由黄芪、薏苡仁、雷公藤、蜈蚣组成，不仅能改善AA大鼠关节症状［18-19］，还可以通过调控蛋白激酶C（PKC）/核转录因子（NF-κB）通路，改善AA大鼠肺功能，通过Toll样受体4/丝裂原活化蛋白激酶通路改善AA大鼠心功能［20-21］。前期研究还表明，XFC通过调节miR-155的表达，抑制NF-κB信号通路活化，改善RA凝血指标，从而改善RA血瘀状态和患者肺功能［22］。本研究结果表明，经不同剂量XFC治疗后，AA大鼠足跖肿胀度和AI显著降低，关节红肿症状明显改善，miRNAs及免疫炎症指标等也显著改善，但其机制有待进一步探究。

綜上所述，hsa-miR-146a-3p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-597-3p、hsa-miR-3184-5p在AA大鼠中均具有差异表达，说明这些miRNAs在RA患者和AA大鼠中表达具有同源性，可进一步进行病毒载体介导的动物体内miRNAs转染实验，研究miRNAs在RA中的调控特点，将有利于揭示RA复杂发病机制，确立RA的关键靶点，为RA临床诊断与治疗提供参考。

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收稿日期：2022-05-15；修回日期：2022-06-17

基金項目：国家自然科学基金面上项目（81973655，82074373）；

科技部国家重点研发计划中医药现代化研究重点专项（2018YFC1705204）；安徽省高校协同创新项目（GXXT-2020-025）；安徽省重点研究和开发计划对外科技合作项目（201904b11020011）；安徽省名中医刘健工作室建设项目（中医药发展秘〔2018〕11号）；安徽省重点研究与开发计划项目（201904a07020004）；安徽现代中医内科应用基础与开发研究省级实验室专项（2016080503B041）；安徽省第12批“115”创新团队项目（皖人才办〔2019〕1号）；新安医学教育部重点实验室开放基金项目（2020xayx10）

作者单位：1.安徽中医药大学，安徽 合肥 230038；2.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031

通信作者：刘健 安徽省合肥市蜀山区梅山路117号，liujianahzy@126.com