王思威，王潇楠，常虹，孙海滨*，刘艳萍*

（1.广东省农业科学院植物保护研究所，广东省植物保护新技术重点实验室，广东广州 510640） （2.华南农业大学广东省昆虫行为调控工程技术研究中心,广东广州 510642）

荔枝和龙眼均是我国南方特色经济水果，中国也是荔枝龙眼年产量最大的国家[1,2]。荔枝以富含丰富的维生素、多糖、黄酮等营养和功能成分著称[3]；龙眼以富含多酚类和黄酮类物质，而被誉为“第七类营养素”[4,5]。目前我国荔枝和龙眼上登记农药种类极少，荔枝登记有效成分48种（杀虫剂10种，杀菌剂23种，除草剂1种，植物生长调节剂14种），龙眼仅登记6种有效成分（杀虫剂2种，杀菌剂1种，植物生长调节剂3种）[6]。苯醚甲环唑属于三唑类杀菌剂，具有内吸性，麦角甾醇生物合成抑制剂，具有很好保护和治疗作用[7]，在荔枝上已登记，是防治炭疽病的主要药剂；氯虫苯甲酰胺是美国杜邦公司开发的首个具有新型邻酰胺基苯甲酰胺类化学结构的广谱杀虫剂[8]，溴氰虫酰胺是杜邦公司开发的第二代鱼尼丁受体抑制剂类杀虫剂[9]，溴氰虫酰胺未在荔枝龙眼上登记，但在生产中多用来防治荔枝蒂蛀虫等虫害。由于荔枝龙眼上已登记的农药数量极少，农药大剂量、多频次的使用导致荔枝龙眼园中病虫害抗性提高[10,11]；荔枝龙眼上农药不规范使用，不仅可引起果品中农药残留污染、超标问题，同时也对环境生物产生毒害，导致对蜜蜂、家蚕等的毒性为中毒或高毒[12,13]。由此引起的果品质量安全问题和环境问题值得关注。

截至2021年8月，关于苯醚甲环唑的检测分析方法有气相色谱法（GC-ECD）、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）[14,15]，前处理方法主要有玻璃层析柱净化、SPE柱净化、QuEChERS净化等[16-18]；氯虫苯甲酰胺和溴氰虫酰胺母体的检测方法有液相色谱法（HPLC）、气相色谱-串联质谱法（GC-MS）和液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS），前处理方法包含SPE净化和QuEChERS净化等[19-24]；溴氰虫酰胺代谢物J9Z38的检测方法为LC-MS/MS[25]。填充柱和固相萃取小柱净化需要大量的有机溶剂，费时且操作繁琐。QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged and Safe）法具有简便、快速、廉价、高效、实用性强等优势，且有机溶剂用量少，并可根据不同样品基质选择吸附剂种类来消除杂质干扰，是当前常用的净化手段[26,27]。LC-MS/MS方法灵敏度高，适用性强，分析时间短，且可同时实现定性定量检测，适于普及和推广[28]。由于上述3种农药及代谢物未见在荔枝龙眼中同时检测分析方法报道，通过建立荔枝龙眼中苯醚甲环唑、氯虫苯甲酰胺、溴氰虫酰胺及代谢物J9Z38的分析方法，可为3种农药的膳食暴露风险评价和对环境指示生物的风险评估提供数据支撑。

本研究采用QuEChERS前处理方法净化样品，HPLC-MS/MS作为检测仪器同时分析荔枝龙眼中苯醚甲环唑、氯虫苯甲酰胺、溴氰虫酰胺及代谢物J9Z38残留，该方法具有较高灵敏度和良好准确度，且操作简便快速，能够满足分析检测要求，填补了荔枝龙眼中3种农药及代谢物同时检测分析的空白，为荔枝龙眼中农药残留安全性分析评价提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

岛津8045三重四级杆质谱仪，（配电喷雾离子源ESI），日本岛津公司；岛津LC-20A高效液相色谱仪，日本岛津公司；Milii-Q超纯水机，美国Millipore公司；GTR22-1离心机，北京时代北利离心机有限公司；XW-80A涡旋仪，上海精科有限公司。

乙腈和甲醇（色谱纯），美国Fisher公司；甲酸（色谱纯），美国Fluka公司；无水硫酸镁、氯化钠，国药集团化学试剂有限公司；十八烷基键合硅胶吸附剂（C18）和N-丙基乙二胺吸附剂（PSA），均购自上海安谱实验科技股份有限公司；纳米氧化锆，上海阿拉丁生物科技有限公司；多壁碳纳米管（multi-walled carbon nanotubes，纯度95%，长度10～30 μm，粒径8 nm），南京先丰纳米材料科技有限公司。标准品：苯醚甲环唑标准品纯度为99.9%，德国Ehrenstorfer GmbH公司；氯虫苯甲酰胺标准品纯度为97.8%，德国Ehrenstorfer GmbH公司；溴氰虫酰胺标准品纯度为98.0%，加拿大Toronto Research Chemicals公司；溴氰虫酰胺代谢物J9Z38标准品纯度为97.8%，杭州创引化工科技有限公司。

1.2 标准溶液的配制

标准储备溶液：分别准确称取苯醚甲环唑、氯虫苯甲酰胺和溴氰虫酰胺及代谢物J9Z38标准品各10 mg（精确至0.1 mg）至4个10 mL容量瓶中，分别加入乙腈溶解，定容至刻度，摇匀，配制成1000 mg/L的标准储备溶液，在4 ℃冰箱中避光保存，待用。

混合标准溶液：分别准确吸取1 mL的苯醚甲环唑、氯虫苯甲酰胺和溴氰虫酰胺及代谢物J9Z38的上述标准储备溶液于同一10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成100 mg/L的混合标准溶液，密封后4 ℃冰箱中避光保存，有效期6个月。

1.3 样品前处理

将荔枝或龙眼样品切碎，然后匀浆，形成均一的试样。分别准确称取荔枝和龙眼全果试样各10 g（精确至0.01 g），加入50 mL离心管中，用10 mL乙腈进行提取，涡旋1 min，加入2 g无水硫酸镁和1 g氯化钠，剧烈振荡，再涡旋1 min，然后以5000 r/min离心2 min。取2 mL上清液，加入装有0.3 g无水硫酸镁、0.010 g Nano-ZrO2、0.050 g PSA和0.050 g C18的离心管中，剧烈振荡，涡旋1 min，以10000 r/min离心5 min。取上清液过0.22 μm有机滤膜，待HPLC-MS/MS检测。

1.4 色谱-质谱条件

色谱条件：安捷伦InfinityLab Poroshell 120 SB-C18色谱柱（75 mm×2.1 mm，2.7 μm）；柱温为35 ℃；进样量为5 μL；流速为0.3 mL/min；流动相A（0.1%甲酸水溶液），B（乙腈），进行梯度洗脱，具体程序为：0～2 min 80% A～5% A，2～3.5 min 5% A，3.5～4.5 min 20% A，4.5～6 min 20% A。

质谱条件：离子源为ESI+；扫描模式为MRM模式；接口温度：300 ℃；DL温度：250 ℃；加热块温度：400 ℃；接口电压：4000 V；雾化气流量：3.0 L/min；干燥气和加热气流量：10.0 L/min。其它质谱参数见表1。

表1 苯醚甲环唑、氯虫苯甲酰胺、溴氰虫酰胺及代谢物J9Z38的质谱参数Table 1 Mass spectra parameters of difenoconazole, chlorantraniliprole, cyantraniliprole and its metabolite

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 提取溶剂的选择

目前，查阅大量文献报道，发现QuEChERS前处理方法中最常用的有机提取溶剂为丙酮、乙酸乙酯和乙腈。丙酮在没有非极性溶剂存在的条件下，不能与水进行分离，而且丙酮容易将基质中的色素等杂质提取，共萃取现象极其严重[29]；乙酸乙酯在提取极性农药时提取效率较低，且易发生乳化现象；乙腈易与水分离，且提取的杂质相对较少，是目前QuEChERS方法中最常用的提取溶剂[30]，因此，本试验选择乙腈作为提取溶剂。

2.1.2 吸附剂的选择和用量

探讨了QuEChERS前处理方法中常用净化剂（Nano-ZrO2、PSA、C18、GCB、MWCNTs）对苯醚甲环唑、氯虫苯甲酰胺、溴氰虫酰胺及代谢物J9Z38的吸附效果及回收率的影响，结果见图1。通过查阅大量文献[26,27,31,32]，发现MWCNTs对农药的吸附性较强，用量一般在5～10 mg范围，GCB、PSA、C18等的用量一般为50 mg，因此，本试验参照文献用量进行。结果显示：当MWCNTs用量在5～10 mg范围时，4种目标化合物的回收率在1.43%～25.71%，其中对溴氰虫酰胺代谢物J9Z38的吸附最严重；50 mg GCB吸附剂对4种目标化合物的回收率也均较低（17.11%～35.94%），因此不宜采用；50 mg PSA、50 mg C18和20 mg Nano-ZrO23种单一吸附剂，对4种目标化合物的回收率均较好，均在90%以上。

荔枝龙眼的基质较复杂，单一吸附剂对共提取杂质的净化效果远弱于混合吸附剂，因此考虑选择PSA、C18和Nano-ZrO2不同吸附剂的组合，C18吸附剂具有比表面积大、吸附能力强等优势，可去除基质中的脂肪、脂类等非极性干扰物；PSA属于弱阴离子交换填料，可有效去除基质中脂肪酸、色素、糖类等物质；纳米氧化锆（Nano-ZrO2）具有比表面积大、吸附容量大等优点，是近年来常用的净化剂。上述吸附剂组合可较好的去除样品中色素、糖等干扰杂质。在吸附剂选择试验结果基础上，考察组合Ⅰ（50 mg PSA+20 mg Nano-ZrO2），组合Ⅱ（50 mg C18+20 mg Nano-ZrO2），组合Ⅲ （50 mg PSA+50 mg C18+20 mg Nano-ZrO2）和组合Ⅳ（50 mg PSA+50 mg C18+10 mg Nano-ZrO2）等4种吸附剂组合对上述4种化合物的回收率情况，结果见图2、表2。实验结果表明，上述复配组合Ⅰ-Ⅳ均可满足实验回收率要求，回收率在85.81%～105.73%。综合考虑实验成本、净化效果等因素，最终选择组合Ⅳ 50 mg C18+50 mg PSA+10 mg Nano-ZrO2作为复配吸附净化剂用于荔枝和龙眼样品基质净化。文献中有关上述4种目标化合物的吸附剂选择有香蕉基质用PSA+C18联合净化[29]、梨基质未经净化直接进样[33]、蔬菜基质用PSA单一吸附剂净化[19]、水果基质用PSA+C18+硅藻土联合净化[20]等报道，由于不同基质的杂质情况不同，如梨和香蕉基质相对较简单，主要为水分和糖分等，色素干扰较少，净化步骤可省略；但部分水果和蔬菜的基质相对较复杂，尤其是大量色素等共萃取杂质的存在，可严重干扰目标物的定量分析，因此其净化步骤尤为重要，可直接影响目标分析物的准确度和灵敏度。

表2 四种吸附剂组合对目标化合物回收率的显著性分析Table 2 Analysis of Significant of four adsorption combination to targeted compounds

2.2 色谱柱的选择

比较了3种不同长度色谱柱对4种目标物的分离效果。A（Shim-pack GIST-HP C18，50 mm）、B（InfinityLab Poroshell C18，75 mm）和C（Poroshell-120 EC-C18，150 mm），谱图见图3。其中色谱柱A的分析时间较短，但对目标农药的响应值及峰型对称性略差；色谱柱C属于长柱，目标分析物的出峰时间相对较长，且有拖尾现象，影响定量结果；色谱柱B分析时间略长于A柱，但明显短于C柱，目标物的响应值和峰型均较好。因此，选择InfinityLab Poroshell C18作为本试验的色谱分离柱。

2.3 流动相的选择

选用2.2中75 mm色谱分离柱，探讨甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-水溶液、乙腈-水溶液等4种流动相组合对目标化合物的分离度和响应强度的影响。结果显示：有机相选用甲醇时，苯醚甲环唑存在峰型不对称、峰展宽等问题，且响应强度较乙腈低；流动相选用乙腈时，通过在水相中加入0.1%甲酸，可促进[M+H]＋离子峰的形成，提高目标物的分析灵敏度，尤其提高了峰型对称性。因此，本研究的色谱流动相选用乙腈-0.1%甲酸水系。

2.4 流动相等度洗脱和梯度洗脱比较

选用乙腈-0.1%甲酸水系作为流动相，探讨了等度洗脱和梯度洗脱对目标化合物分离度和响应值的影响，见图4。结果显示梯度洗脱不仅提高了4种目标农药的响应值，而且峰型十分对称，可有效将杂质与目标化合物分离，提高定量结果的准确度。

2.5 质谱条件的优化

通过查阅大量文献，明确了4种目标化合物在正离子模式下分析。为提高目标化合物的离子化效率，对源内参数开展了优化实验，相关色谱图见图5。在正离子模式下，对化合物进行全扫描分析，一级质谱扫描可获取[M+H]+分子离子，以此来确定目标分析物的母离子；然后再进行产物离子扫描，获取产物离子，最后在MRM模式下对4种目标化合物的CE、Q1 Pre偏差、Q3 Pre偏差等参数进行优化，优化后的色谱图不论是峰型对称性还是响应值均好于优化前。

2.6 基质效应

基质效应（ME）是液质分析定量结果准确性的最重要影响因素。本试验采用下式计算基质效应：ME(%)=［(mmatrix/msolvent)-1)］×100%，其中mmatrix为基质匹配标准曲线的斜率，msolvent为纯溶剂标准曲线的斜率。当ME为正值时，表示存在基质增强效应，基质可提高目标物效应；ME为负值时，表示存在基质抑制效应，基质可降低目标物效应；ME=0时，表示不存在基质效应。表3实验结果表明，苯醚甲环唑、氯虫苯甲酰胺、溴氰虫酰胺及其代谢物在荔枝龙眼中均存在基质抑制作用，基质效应值在-79.12%～-33.54%，本实验采用基质匹配标准溶液来校正基质效应。

表3 苯醚甲环唑、氯虫苯甲酰胺、溴氰虫酰胺及代谢物J9Z38在荔枝龙眼中的加标回收率、相对标准偏差、检出限、定量限等参数Table 3 Matrix effect, recoveries, RSDs, LOD, LOQ and other parameters of difenoconazole, chlorantraniliprole, cyantraniliprole and its metabolite J9Z38 in litchi and longan samples (n=5)

2.7 方法学评价

2.7.1 线性范围、检出限与定量限

在1～100 μg/kg浓度范围内，以基质匹配标准溶液的质量浓度（x，μg/L）为横坐标，其所对应的目标化合物的响应值（y）为纵坐标作图，得到苯醚甲环唑、氯虫苯甲酰胺、溴氰虫酰胺及代谢物J9Z38的基质匹配标准溶液线性方程，线性相关系数（r2）均大于0.99。根据欧盟文件SANTE/11813/2017规定，当最小添加水平回收率满足70%～120%及相对标准偏差≤20%时，定量限（LOQ）可以为最小添加水平。本方法对苯醚甲环唑的LOQ为0.1 μg/kg，低于稻米[34]（10 μg/kg）、梨[33]（10 μg/kg）和香蕉[29]（40 μg/kg）中的报道值；氯虫苯甲酰胺LOQ为1 μg/kg，均低于茶叶[35]（5 μg/kg）、水果[31]（17.2 μg/kg）等基质中的报道值；溴氰虫酰胺LOQ分别为1 μg/kg，均低于南瓜[36]（10 μg/kg）、蓝莓[24]（6 μg/kg）等基质中的报道值，说明本文建立的分析方法具有较低的灵敏度，可适用于荔枝龙眼样品的痕量分析。

2.7.2 回收率与精密度

在荔枝龙眼的空白样品中分别添加10、50、100 μg/kg 3个浓度水平的4种目标物混合标准溶液，每个 加标水平重复5次，并作空白对照，具体结果见表3。4种目标物在荔枝龙眼中的加标回收率为82.48%～ 99.17%，日间和日内相对标准偏差（RSD）分别为4.11%～7.77%和6.10%～13.27%。荔枝空白样品加标的色谱图见图6。本方法具有较高的回收率和良好的精密度，可满足荔枝和龙眼样品检测要求。

2.8 方法的应用

采用本方法对市场中随机购买的20份荔枝龙眼样品进行检测，具体结果见表4。苯醚甲环唑和氯虫苯甲酰胺在荔枝龙眼中均有检出，溴氰虫酰胺及代谢物J9Z38的残留量均未检出。仅苯醚甲环唑在荔枝上有最大残留限量值（MRLs）[37]，所测实际样品中苯醚甲环唑残留量低于MRLs。

表4 4种目标分析物在荔枝龙眼实际样品中的残留量（mg/kg）Table 4 Residues of four targeted compounds in real litchi and longan samples (mg/kg)

3 结论

本文建立了QuEChERS结合HPLC-MS/MS同时测定苯醚甲环唑、氯虫苯甲酰胺、溴氰虫酰胺及代谢物J9Z38在荔枝龙眼基质中的检测方法，该方法有较好的检测灵敏度和准确度。样品前处理过程操作简便，回收率高，检出限低，满足定性和定量要求，适用于荔枝龙眼中苯醚甲环唑、氯虫苯甲酰胺、溴氰虫酰胺及代谢物J9Z38定性定量分析要求，可为上述农药在荔枝龙眼中的风险监控提供有效的技术支持。