李可，朱永清，邬应龙，袁怀瑜，潘翠萍，周艳，廖茂雯，李华佳*

（1.四川省农业科学院农产品加工研究所，四川成都 610066）（2.四川农业大学食品学院，四川雅安 625014）

随着居民健康意识的提高，消费者尤其是素食主义者、乳糖和酪蛋白不耐受以及高血脂风险人群对益生性果蔬产品表现出极大的兴趣[1]。因此，益生菌、植物基成为科学界和市场当下最流行的，最受欢迎的重要的功能原料，展现了巨大的科学研究与商业价值。研究表明，摄入适量的活的益生菌有利于保持和改善宿主肠道微生物菌群结构[2,3]，可抑制或治疗健康问题如乳糖不耐受症、高血压、抗生素相关腹泻等[4]，日常饮食中摄入含有益生菌的食物对减轻肠易激综合征、降低血清胆固醇、增强先天免疫[5]等具有一定效果。果蔬汁富含维生素、矿物质、膳食纤维及抗氧化功能活性物质，具有抗菌、消炎、调节肠道菌群、抗氧化等功能活性[6,7]。研究表明，乳酸菌应用于果汁产品开发，能够降低果汁pH值，在一定程度上保持原有的营养和功能活性成分，提升风味品质，提高营养健康属性[8-11]。

猕猴桃属于猕猴桃科、猕猴桃属，是一种落叶藤蔓果树，其果实不仅质地柔软、口感酸甜，还富含膳食纤维、氨基酸、多酚、维生素和矿物质元素等，其Vc含量是苹果、橘子等其它水果的数倍，被誉为Vc之王，对人体健康有积极促进作用[12]，深受消费者的喜爱，是夏季主流水果之一。据世界粮农组织统计显示，最近十年全球猕猴桃的种植面积和总产量分别增加了71.25%和55.58%[13]。我国是猕猴桃主产国之一，2018年猕猴桃栽培面积2.4×105hm2，占全球猕猴桃总量的70%以上，居世界第一[14]。目前我国猕猴桃消费主要以鲜果和贮藏果为主，但猕猴桃属于呼吸跃变型浆果，对乙烯极为敏感，采收后对贮藏技术和工艺设备依赖性强，大量鲜果集中成熟如不能得到有效贮藏，则很容易造成鲜果腐烂，失去商品价值。因此本文拟采用植物乳杆菌发酵猕猴桃原浆，探讨植物乳杆菌在猕猴桃原浆中发酵性能，解析植物乳杆菌发酵对猕猴桃原浆风味物质的影响，以期为益生菌发酵技术在猕猴桃精深加工中应用提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红阳猕猴桃采自都江堰市胥家镇，9月中旬采摘，去除有损伤或腐烂果实。

菌种：Lactobacillus plantanumB-1分离自传统发酵泡菜，经16S rRNA鉴定为Lactobacillus plantanumJCM1149，保存于四川省农业科学院食物营养与健康研究所果蔬贮藏加工实验室。

MRS肉汤/琼脂培养基，北京索莱宝公司；0.1 mol/L NaOH，上海阿拉丁公司。

1.2 仪器与设备

PHS-3C型pH计，上海雷磁公司；PAL-1糖度计，日本爱拓公司；855全自动进样滴定系统，瑞士万通；气相离子迁移谱分析与质量控制系统，德国G.A.S公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵工艺流程

果汁制备：选取表面无机械伤、无病斑的猕猴桃，置于催熟箱中，0.1 mL/L浓度乙烯20 ℃催熟24 h，散去乙烯，20 ℃放置货架待果实硬度降低至0.3～0.5 N。自来水清洗后，去皮，延猕猴桃纵轴切成0.6 cm的薄片，铺展于洁净托盘中，-20 ℃冷冻10 h，室温下解冻至融化，4 ℃4000 r/min离心10 min取汁。

灭菌：采用巴氏灭菌，灭菌条件为72 ℃、15 min，灭菌后果汁（YL）应用于发酵和风味分析。

菌种制备：10 µL -80℃保存菌种接种至MRS液体培养基中，37 ℃培养26 h，5000 r/min离心收集菌体，无菌水洗涤菌体2次后，备用。

接种发酵：根据血细胞计数板结果，向乳酸菌发酵组（PL）中按照1:100的比例接种已经活化的菌种，使初始菌浓度保持在106CFU/mL，接种后37 ℃发酵96 h，每24 h取样1次进行检测指标。同时设置对照组（CK）即不接种植物乳杆菌，其放置条件和取样方法同PL，每个处理3个平行。

1.3.2 常规理化指标检测

1.3.2.1 菌落数

参考国标GB 4789.35-2016[15]。

1.3.2.2 pH采用

参照农业行业标准NY 82.7-1988，采用pH计直接测定[16]。

1.3.2.3 总酸（TA）

采用自动滴定仪进行测定，结果以苹果酸计。

1.3.2.4 可溶性固形物（SSC）

采用手持式糖度计测定。

1.3.3 HS-GC-IMS分析

1.3.3.1 自动进样器条件

孵化温度60 ℃，孵化时间5 min，顶空进样，加热方式为振荡加热，振荡速率500 r/min，进样针温度65 ℃，进样量500 µL，不分流，清洗时间0.5 min。

1.3.3.2 GC条件

FS-SE-54-CB-1石英毛细管柱（15 m×0.53 mm，1 µm），色谱柱温度60 ℃，载气为N2（纯度≥99.999%），载气流速程序为初始流速设置为2.0 mL/min，持续2 min，18 min内逐渐提升至100.0 mL/min；运行时间20 min。

1.3.3.3 IMS条件

漂移管长度98 mm，管内线性电压500 V/cm，漂移管温度45 ℃，漂移气为N2（纯度≥99.999%），漂移气流速150 mL/min），放射源：β射线（氚，3H），离子化模式为正离子。

1.3.3.4 样品测定

移液管转移2 mL果汁于20 mL顶空进样瓶中，60 ℃保温15 min后进样。

1.4 数据分析

采用SPSS 19.0分析软件中Duncan新复极差法对理化指标数据进行显著性检验分析，柱状图采用Originpro 2019b绘图；运用SIMCA 14.1软件作图并进行PLS-DA分析。

2 结果与讨论

2.1 植物乳杆菌在“红阳”猕猴桃果汁中的生长及产酸能力

果蔬汁因含有糖等多种营养成分，是优良的益生菌载体，但不同菌种在不同基质中发酵性能差异较大。Espirito-Santo等比较分析了不同菌种在不同基质中的发酵性能，结果表明，相较于葡萄籽和橘子汁，苹果汁是最适宜于乳酸菌的生长，相较于Lactobacillus rhamnosusLGG、Lactobacillus paracaseiLp33、Lactobacillus plantarum299v等，Lactobacillus acidophilusL10最适宜于苹果汁发酵[17]。因此采用益生菌发酵果蔬汁首先需要考虑菌株在基质中的发酵性能。而乳酸菌生长特性和产酸性能是评价益生菌发酵性能的重要指标[1]，根据FAO/WHO的定义，只有摄入足量活的益生菌才能对食用者的身体健康能发挥有益作用[18]，目前研究认为，食品中益生菌最低活菌数含量要达到106～107CFU/mL或CFU/g才能够经过消化道对人体健康发挥有益作用[19,20]。因此，本文首先分析了植物乳杆菌Lactobacillus plantanumB-1在猕猴桃果汁中的生长性能及产酸能力，结果如图1。

由图1可知，CK中乳酸菌数量数量始终为0，表明在发酵过程中无菌体污染等现象。PL中植物乳杆菌生长迅速，24 h内菌落数由原来的6.21 lg CFU/mL快速上升至8.60 lg CFU/mL，而后趋于稳定，并保持在8.4～8.9 lg CFU/mL，说明该菌在猕猴桃果汁中生长性能优良[21-24]。同时，随着乳酸菌的生长繁殖，糖类等物质的消耗，PL中TA含量0～48 h快速上升，由原来的0.60%增加至1.33%，增加量约为原来的122%，同时pH值呈显著下降（p<0.05），说明该菌在猕猴桃基质中具有较强的产酸能力，发酵性能优良。通过以上分析可知，菌株Lactobacillus plantanumB-1在猕猴桃果汁中生长迅速，产酸能力强，说明该菌在“红阳”猕猴桃汁中发酵性能良好，适宜于猕猴桃果汁发酵。

2.2 PL、YL、CK样品HS-GC-IMS分析

乳酸菌发酵被认为是保持甚至提高果蔬汁的风味和营养品质、延长其货架期最简单有效的生物技术手段，同时还有利于果汁风味的提升[21,25]。由2.1研究结果可知，发酵72 h后菌落数、有机酸等指标均趋于稳定，视为发酵终点。因此本文以发酵72 h样品为研究对象，通过HS-GC-IMS比较YL、CK、PL三组样品中挥发性成分解析植物乳杆菌对猕猴桃果汁风味的影响，结果见图2。

图2显示了PL、YL、CK样品挥发性物质指纹图谱，图中以蓝色为背景，横坐标和纵坐标分别代表样品中物质分离时相对于反应离子峰（RIP）的漂移时间和气相保留时间，横坐标1.0处竖线为RIP峰，其两侧RIP峰两侧的斑点代表物质，斑点的有无和颜色的深浅表示物质的积累和分解程度，颜色由白色到红色表示浓度由低到高。根据斑点变化可知PL、YL、CK样品在离子峰的位置、数量、强度和时间上均有差异。说明，PL、YL、CK三个样品在挥发性物质组成上存在明显差异，植物乳杆菌发酵和贮藏均会对果汁风味物质产生影响。

2.3 PL、YL、CK样品VOCs组成分析

根据GC保留时间和离子迁移时间对PL、YL、CK样品挥发性风味物质组成进行定性分析，通过与NIST 2014气相保留指数数据库、IMS迁移时间数据库比对共鉴定出61（不区分单体、二聚体为50种）种挥发性物质，包括醛、酯、醇、酮、酸及含硫化合物等六个大类（结果见图3）。

图中以蓝色为背景，每个斑点代表样品中物质组分，且颜色由白色到红色表示浓度由低到高。根据图中斑点分布及颜色可知，PL、YL、CK样品中物质种类和含量均发生了明显的变化，其中植物乳杆菌发酵果汁物质种类最为丰富。YL中主要挥发性物质由高到低依次为乙酸乙酯、(E)-2-己烯醇-D、1,8-桉叶素-M、己醛、1,8-桉叶素-D、2,3-戊二酮、丁酸乙酯、丙醛、(E)-2-己烯醇-M、3-甲基丁醛、乙醇及呋喃甲醛及未知物4等。PL中主要挥发性物质由高到低依次为乙酸乙酯、1,8-桉叶素-M、(E)-2-己烯醇-M、丙醛、1,8-桉叶素-D、2-庚酮、呋喃甲醛-D、己醛、乙醇、呋喃甲醛-M、3-甲基丁醛、乙酸-3-甲基丁酯、(E)-2-己烯醇-M、1-己醇、2-庚酮-M及未知物2等。CK主要挥发性物质由高到低依次为乙酸乙酯、呋喃甲醛-D、乙醇、丙醛、未知物2、未知物4、乙酸丙酯、3-甲基丁醛、1,8-桉叶素M、乙酸-3-甲基丁酯、1,8-桉叶素D、(E)-2-己烯醇-D。

2.4 PL、YL、CK样品挥发性风味物质PLS-DA分析

根据HS-GC-IMS得到不同样品风味物质指纹图谱，能简单直观的看出三种挥发性风味物质轮廓的差异性及部分高含量物质的变化。但因为每个物质的变化都在不同程度上对样本的差异带来一定影响，为了更好地进行3种样品风味识别并获得差异化合物，运用SIMCA 14.1软件基于50种挥发性物质应用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）方法分析植物乳杆菌发酵对猕猴桃果汁挥发性化合物的影响。结果见图4。

模型的主成分回归系数Q2为0.986大于0.5，说明模型的预测能力较好；Ry2为0.996，说明模型对因变量变异贡献的百分比为99.6%，即自变量的变化能解释导致99.6%因变量发生，模型拟合度较好。由样品分布图（图4）可以看出，PL、YL、CK样品得到很好的分离，表明三者之间风味物质存在显著差异。

VIP值可以量化PLS-DA的每个变量对分类的贡献，VIP值越大，变量在样品之间的差异越显著。为了获得PLS-DA模型下区分三个样品的关键差异挥发性化合物，筛选出VIP>1的重要差异化合物22种（图5）[26]。(E)-2-己烯醇、己醛、2,3-戊二酮、二甲基三硫五种化合物在YL具有较高贡献值，表明以上这些物质在YL中含量显著高于PL和CK。1-丁醇、5-甲基-2-呋喃甲醇、芳樟醇、庚醇、己醇、(E)-2-己烯醛、苯甲醛、壬醛、辛醛、丙酸乙酯、己酸丙酯、乙酸戊酯、2-庚酮、2-己酮、2-壬酮、戊酮、丙酮等17种物质在PL具有较高贡献值，表明PL中以上17中物质显著高于发酵CK和YL。Annalisa等[22]、Chen等[23]的研究也表明，植物乳杆菌发酵可分别提高接骨木果中芳樟醇、乙醇含量以及苹果果汁中己醇、芳樟醇、乙醇、3-甲基丁醇、乙酸乙酯、丁酸乙酯、2-庚酮、2-壬酮等含量。

2.5 植物乳杆菌发酵对猕猴桃果汁风味品质影响分析

发酵果汁的风味物质对产品的最终感官品质起着决定作用并影响消费者的接受度[4,20,27]，果蔬汁中含有丰富的酚类、脂肪酸、氨基酸、糖、有机酸等风味前体物有利于乳酸菌发酵过程中风味物质的产生[27]。研究认为，酯类如乙酸乙酯、丁酸乙酯以及酮类和酚类有利于提升发酵产品的风味品质，赋予产品甜香味和果香味，高含量的醇如2-乙基己醇、酮以及萜烯类与果汁中花香和果香味[4,28]。Chen等[23]采用GC-MS解析了乳酸菌发酵对果汁风味的影响，表明乳酸菌发酵可产生大量新的挥发性物质如2-庚酮、2-壬酮、4-环戊烯-1,3-二酮和乙醛等，同时提升酯和醇类物质含量。Cagno等[28]研究表明乳酸菌发酵石榴汁中挥发性化合物如醇、酮、烯烃、萜烯以及苯衍生物等有所上升，而具有臭味的某些醛类显著下降。植物乳杆菌、干酪乳杆菌发酵番茄汁可显著增加酮、醇或酸的含量，降低烃类、醛类和酯类的含量，其它菌株如鼠李糖乳杆菌和干酪乳杆菌能够增加一些关键化合物如乙偶姻、二乙酰等具有奶油味的物质含量[1]。以上研究结果表明，乳酸菌发酵有利于果蔬汁风味提升，且乳酸菌发酵对果汁风味的影响与基质、菌种等密切相关。

草香和果香是红阳猕猴桃的特征风味，该风味的物质基础包括1,8-桉叶素、(E)-2-己烯醇、己醛、(E)-2-己烯醛、己醇、丙酮、丁酸乙酯、乙酸乙酯等[29,30]，其中1,8-桉叶素有樟脑气息和清凉的草药味[31]，(E)-2-己烯醇、(E)-2-己烯醛、己醛等具有草、叶的清香味，1-己醇具有果香味、丁酸乙酯、乙酸乙酯及丙酮等具有果香味[31,32]。本文采用GC-IMS结合PLS-DA通过分析比较PL、CK、YL三组样品之间风味物质变化及重要差异化合物解析植物乳杆菌发酵对猕猴桃果汁风味品质的影响。结果显示YL中(E)-2-己烯醇、己醛、2,3-戊二酮、二甲基三硫五种物质显著高于CK和PL，其中(E)-2-己烯醇、己醛具有草、叶的清香味是猕猴桃特征风味物质[29,30]。二甲基三硫为一种阈值较低的具有硫臭气味的物质，是果汁中刺激性气味的主要物质之一，但该物质不稳定，72 h后PL和CK样品中含量显著降低，因此发酵和静置对降低果汁中二甲基三硫具有积极作用。PL中1-丁醇、芳樟醇、(E)-2-己烯醛、2-庚酮、丙酸乙酯等物质的含量显著高于CK和YL，且PL中猕猴桃汁中重要风味物质1,8-桉叶素与YL基本保持一致，显著高于CK。其中(E)-2-己烯醛是猕猴桃中最主要的风味物质[29,30]，且风味与己醛较为接近，该物质的增加能够有效补充PL中己醛减少带来的猕猴桃青草香风味的损失，从而保持发酵后果汁仍然保留猕猴桃特有的青草香风味。同时，PL中1-丁醇、2-庚酮、己醇、丁酸乙酯等含量的生成又会增加果汁的甜香和果香味，有利于猕猴桃果汁风味品质的提升[7,29,30]。在CK中，不仅1,8-桉叶素、(E)-2-己烯醇、己醛、(E)-2-己烯醛、己醇、丙酮、丁酸乙酯等猕猴桃特征风味物质显著降低，同时，CK中糠醛、乙醇等对果汁风味和品质产生不利影响的物质含量还显著高于YL和PL[32,33]，由此可知CK组相较与CK、PL发生了品质劣变。

综上分析可知，植物乳杆菌发酵能够提升猕猴桃果汁的风味品质，主要表现在降低二甲基三硫等物质含量，减少刺激性气；提高(E)-2-己烯醛、己醇、芳樟醇、乙酸乙酯、丁酸乙酯，丙酮、2-庚酮、2-壬酮等含量，减少桉叶素、(E)-2-己烯醇、己醛风味物质的损失，抑制乙醇、糠醛等物质的生成，保持猕猴桃汁原有的青草香气，提升风味品质。

3 结论

3.1 分析了植物乳杆菌发酵在猕猴桃中的总菌落数、TA、pH值等变化，结果表明37 ℃条件下，植物乳杆菌在猕猴桃果汁中数量24 h内由6.21 lg CFU/mL上升至8.60 lg CFU/mL并保持稳定，且TA含量在48 h内由原来的0.60%增加至1.33%，pH值呈显著下降（p<0.05）。说明该菌在猕猴桃基质中生长迅速，产酸能力强适宜于猕猴桃果汁发酵。

3.2 GC-IMS结合PLS-DA分析结果显示，植物乳杆菌代谢活动可显著提高对果汁风味起到积极作用的物质如(E)-2-己烯醛、己醇、芳樟醇、乙酸乙酯、丁酸乙酯，丙酮、2-庚酮、2-壬酮等含量，减少桉叶素、(E)-2-己烯醇、己醛风味物质的损失，抑制乙醇、糠醛等物质的生成，从而达到提升猕猴桃果汁风味品质的目的。

3.3 该研究为植物乳杆菌发酵猕猴桃果汁产品开发的可行性提供了科学依据，也为进一步基础研究如植物乳杆菌发酵对果汁滋味物质如氨基酸、有机酸、糖以及功能活性的影响奠定了良好基础。