史添立 罗贞 焦石

系统性红斑狼疮是一种累及多系统的自身免疫病，狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN）是系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）主要致死原因［1］。肾间质纤维化为后期慢性病理表现，组蛋白乙酰化酶去乙酰化是调控基因表达的重要方式，参与各种生理病理过程［2］。HDAC3 作为组蛋白去乙酰化酶（histonedeacetylase，HDAC）家族中一员，近来有研究表明HDAC 在参与肾脏病发生与发展并发挥重要作用［3］。转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）能够促进成纤维细胞增殖，诱导肾小管上皮细胞向间充质细胞转变（epithelial mesenchymal transition，EMT），调节细胞外基质合成增加，是肾脏纤维化最关键作用因子［4］。本研究检测HDAC3、TGF-β1 的表达及评估肾间质纤维化的关系，探讨HDAC3、TGF-β1与狼疮肾间质纤维化三者之间的关系。为下一步将组蛋白去乙酰化酶抑制剂做为肾间质纤维化的临床治疗潜在的实用价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2017年6月至2020年9月海口市人民医院收治的LN 患者53 例，其中男性患者11 例，女性42 例；平均年龄（34.12±12.04）岁。SLE 诊断符合2019年EULAR 的系统性红斑狼疮（SLE）分类标准［5］，LN 均经肾脏病理检查确诊，肾脏病理分型是依据2003年国际肾脏病学会（ISN）/RPS 制定的分类标准确定［6］。同时选取相对应时间内收治的原发性肾病综合征（nephrotic syndrome，NS）患者10 例作为对照组，其中男性6 例，女性4 例；平均年龄（35.10±4.36）岁。NS 的分类诊断标依据为大量蛋白尿（尿蛋白定量24 h＞3.5 g）、低白蛋 白血症（血清白蛋白≤30 g/L）［7］、高脂血症、水肿，并除外其他继发因素。所有患者均行肾脏组织活检。所有患者及家属均知情同意。本实验经医院伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 标本处理

狼疮性肾炎患者进行肾脏病理检查并进行病理分型登记，肾组织常规进行HE 染色、PAS 染色、PASM 染色、Masoon 三色染色及肾脏病理指数评分（包括活动指数及慢性指数）［8］。计算肾间质纤维组织相对面积（Masoon 染色法观察肾间质绿染区面积/视野总面积×100%）［9］。

1.2.2 免疫组织化学方法检测肾脏HDAC3 和TGF-β1 表达情况

①实验方法：取狼疮患者肾脏病理组织切片烤干，试剂HDAC3 及TGF-β1 采用Abcam 厂家，二抗Leica novocastra NovoLink 聚合物检测系统RE7280-K 检测试剂盒lot：6078783。将已烤干的切片脱蜡；新鲜配制抗原修复液选用选自基因科技（上海有限公司）GT100411（50X 浓缩液）40 mL+2L 蒸馏水（抗原修复工作液pH9.0）高压锅内混匀；将已冲洗干净组织切片加热煮沸后冷却后将组织切片用流水冲洗干净移至蒸馏水中浸泡2 min。3% H2O2中浸泡8 min，流水冲洗蒸馏水冲洗。取出切片，PBS 冲洗；甩去待测组织切片上多余的PBS 后滴加一抗抗体，阳性、阴性对照片上也滴加同样的抗体，对照片上滴加PBS 缓冲液。将切片放入孵育盒至冰箱中孵育18～24 小时后放置室温30 min 恢复室温；用PBS 洗3 次，滴加NovoLink 聚合物检测系统RE7159 后放入37℃恒温箱中孵育30 min。之后PBS 洗3 次，滴加NovoLink聚合物检测系统RE7161 后孵育30 min。PBS 洗3次，将切片使用NovoLink 聚合物检测系统试剂盒中的试剂RE7163 2 mL 和NovoLink 聚合物检测系统试剂盒中的试剂RE7162 20 μL 混匀DAB 显色液中显色5 min，在显微镜下控制染色的强度；将切片置自来水中终止显色，再用流水冲洗10 min；苏木素染液复染1 min，0.5%盐酸酒精分化3 秒钟；流水冲洗10 min，返蓝；脱水、透明、封片、镜检；②判读方法［10］：在高倍镜下观察，分析每个视野中阳性细胞数的平均数作为该切片的阳性细胞百分比进行积分：0%～5%为0 分，6%～25%为1 分，25%～50%为2 分，51%～75%为3 分，＞75%为4 分；染色强度以多数阳性细胞呈现的染色特征为标准计分：无染色为0 分，淡黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分。二者相加，0～1 分为阴性（-），2～3 分为弱阳性（+），4～5 分为中等阳性（++），6～7 分为强阳性（+++），其中（-）和（+）记为低表达组，（++）和（+++）记为高表达组。染色强度：弱染色：在40X 物镜视野才能看到细胞染色。强染色：在4X 或10X 物镜视野能看到的细胞染色。

1.3 统计学处理

采用SPSS 22.0 统计软件进行统计学分析，计数资料用n表示，行χ2检验。计量资料采用（±s）表示，两组间比较用t检验，多组间用F检验。Pearson（正态分布）或Spearman（非正态分布）检验进行相关性分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者肾脏组织中HDAC3、TGF-β1 表达的比较

HDAC3 主要表达于肾脏肾小管上皮细胞中。SLE 组患者肾组织中HDAC3 的表达水平高于对照组［（6.32±2.31 vs 3.12±1.81）］，差异有统计学意义（P＜0.05）。伴有肾间质纤维化的LN 患者HDAC3表达高于无纤维化患者［（6.78±2.19）vs（2.43±2.01）］，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图1。

图1 肾组织中HDAC3 和TGF-β1 表达（SP，×400）Figure 1 HDAC3 and TGF-β1 expression in kidney tissue（SP，×400）

2.2 SLE 患者临床表现与肾脏组织HDAC3 和TGF-β1 表达的关系

肾脏组织HDAC3、TGF-β1 表达均与血肌酐、浆膜炎、口腔溃疡、关节炎、间质性肺炎、神经系统损害、24 小时尿蛋白及血液系统损害有关（P＜0.05）。见表1。

表1 SLE 患者临床表现与肾脏组织 HDAC3、TGF-β1 表达的关系（±s）Table 1 The relationship between clinical manifestations of SLE patients and the expression of HDAC3 and TGF-β1 in renal tissue（±s）

表1 SLE 患者临床表现与肾脏组织 HDAC3、TGF-β1 表达的关系（±s）Table 1 The relationship between clinical manifestations of SLE patients and the expression of HDAC3 and TGF-β1 in renal tissue（±s）

临床表现血肌酐升高n t 值6.677 P 值＜0.001 t 值5.964 P 值＜0.001浆膜炎4.715＜0.001 4.495＜0.001口腔溃疡6.839＜0.001 6.100＜0.001关节炎12.441＜0.001 4.673＜0.001间质性肺炎20.003＜0.001 4.002＜0.001神经系统损害10.132＜0.001 3.786＜0.001 24 小时尿蛋白大于3.5g 11.234＜0.001 8.121＜0.001血液系统损害是否是否是否是否是否是否是否是否42 11 17 36 21 32 33 20 14 39 18 35 30 23 28 25 HDAC3 表达6.53±2.02 3.35±1.21 6.87±2.00 3.98±1.76 6.32±2.10 2.90±1.12 5.93±1.76 1.73±0.65 8.21±2.67 3.32±1.28 6.57±2.14 3.12±1.00 6.56±1.97 3.23±1.21 5.85±1.79 2.67±1.01 6.908＜0.001 TGF-β1 表达4.43±1.67 2.11±0.98 6.34±2.15 3.87±1.00 5.87±1.78 3.67±1.21 4.66±1.08 1.23±0.54 4.11±1.88 1.84±0.45 5.65±2.10 2.11±1.25 5.97±2.14 1.88±0.98 6.44±1.89 2.65±1.01 4.037＜0.001

2.3 肾组织中HDAC3 表达与TGF-β1 表达的关系

肾组织HDAC3 表达与TGF-β1 表达呈正相关（r=0.745，P＜0.001）。

3 讨论

LN 是SLE 的严重并发症，其发病机制涉及自身抗体与自身抗原形成免疫复合物沉积、细胞浸润、足细胞和内皮细胞损伤等［5-6］。越来越多研究显示，表观遗传学变化在LN 发生发展中起到重要作用［7-8］。HDAC 是一组表观遗传修饰蛋白，通过催化组蛋白或非组蛋白赖氨酸残基的去乙酰化调节基因表达。HDAC 可以参与SLE 在内的多种免疫疾病的发生发展［7］。HDAC3 是HDAC 家族重要成员之一，可以在细胞核和细胞浆中穿梭。HDAC3 在人体各个组织中均有表达，在细胞增殖、分化、细胞周期调控、免疫系统发育中发挥重要作用［8］。近年来研究发现，HDAC3 与肾脏疾病的发生密切相关，例如肾癌、肾纤维化、慢性肾病、多囊肾、糖尿病肾病等［9］，在哺乳动物中，组蛋白的乙酰化受到组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferases，HATs）和HDACs 的动态调控。通常情况下，HDACs 通过去乙酰化赖氨酸残基和恢复染色质组蛋白的正电荷导致染色质凝聚，阻碍转录因子的进入，最终抑制相关基因表达。其机制可能与HDAC3 调控免疫炎症、氧化应激等有关［10］。肾间质纤维化以肾成纤维细胞异常活化及增生为特点，特征性改变包括α-SMA 表达及细胞外基质成分的增加。成纤维细胞的活化及增殖需要大量的生长因子及细胞因子如TGF、血小板衍生生长因子（PDGF）、成纤维细胞生长因子、白介素6（IL-6）等的参与［11］。TGF-β1 是一种具有多种功能的蛋白多肽，其主要来源自淋巴细胞、单核细胞、血小板和肝枯夫氏细胞等，与免疫炎症损伤、组织纤维化密切相关［12］。既往研究已证实，TGF-β1 与LN的发生有关，并且参与纤维化的过程［13］。本研究结果进一步说明HDAC3 与LN 肾组织纤维化有密切的关系，其可能机制为在肾脏纤维化形成过程中，HDACs 的上调了影响促纤维化生长因子、细胞信号分子、细胞外基质蛋白和肾脏抗纤维化蛋白的表达。例如，HDACs 抑制剂可明显上调抗纤维化蛋白Klotho 及BMP-7 的水平，最终抑制肾脏纤维化的进展［14］。也有研究表明，肾小管上皮细胞HDAC3 特异性敲除或使用HDAC3 特异性抑制剂RGFP966 均可减轻输尿管结扎引起的肾脏纤维化，其机制可能与HDAC3 对抗纤维化蛋白Klotho的抑制有关［15-16］。另外也有研究发现，HDAC 依赖的Bmp7 转录调控，可以促进TGF-β1 表达，进而参与肾脏纤维化［17］。以上均为HDAC3 参与肾纤维化的可能机制，但仍需进一步研究证实。此外，本研究结果提示HDAC3 可能也参与在狼疮病情活动方面的机制，但需进一步大样本证实。本研究目前存在一定的局限性：①为单中心研究，样本量较小；②未对患者进行随访，不能明确HDAC3与TGF-β1 与SLE 患者预后的关系；③本研究仅检测了患者肾组织中HDAC3 与TGF-β1 的表达，未直接验证二者的相互调控关系及具体的机制；④未检测HDAC3 相关组蛋白的表达水平及意义。

综上，LN 患者的肾组织HDAC3 和TGF-β1 的表达水平明显升高，另外HDAC3 和TGF-β1 与LN纤维化密切相关，伴有肾间质纤维化LN 患者的HDAC3 和TGF-β1 表达水平高于无纤维化患者，未来需要进一步开展细胞及动物研究，明确HDAC3 与TGF-β1 的相互调控关系及其机制。