张磊 龚跃昆 尹勇*

1. 云南大学附属医院康复医学科，云南 昆明 650000 2. 昆明医科大学第一附属医院骨科，云南 昆明 650000

骨质疏松症是一种全身代谢性骨病，其特征为骨密度降低、骨组织显微结构破坏及易于骨折，显著增加患者死亡率和致残率[1-2]，已经对全球公共卫生构成极大挑战。然而骨质疏松症的病因及发病机制目前仍然不清楚，其中BMSCs成骨与成脂肪分化失衡是骨质疏松发病的重要机制之一，即BMSCs向成脂肪分化增加而向成骨分化明显减少，因此如何促进BMSCs向成骨分化而减少成脂分化是目前研究的热点[3-4]。成骨生长肽(OGP)由14个氨基酸残基组成的多肽，羧基端五肽为其活性形式。现在已经可以人工合成OGP，其能够明显促进BMSCs增殖和成骨分化[5-6]，但是关于OGP对间充质干细胞成脂分化影响的报道非常少[7]。越来越多的研究[8-9]表明低氧环境培养能明显影响BMSCs成骨成脂分化，同时我们前期研究表明低氧环境及OGP均能促进BMSCs的成骨分化[10]；而现有研究[11-12]关于低氧对BMSCs成脂肪分化影响的报道并不一致。本文拟探讨OGP、低氧及二者联合对BMSCs成脂肪分化的影响，以期为骨质疏松症的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SPF级昆明小鼠(昆明医科大学实验动物中心)，成骨生长肽(北京博奥森)，PPARγ抗体(Bioss公司)，C/EBPα抗体(Proteintech公司)，GAPDH抗体(CST公司)，HIF-1α ELISA试剂盒(R&D公司)，低糖DMEM培养基(Sigma公司)，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(Sigma公司)，胰岛素(Sigma公司)，Platinum® SYBR® Green qPCR试剂盒(Invitrogen公司)，Golden Taq PCR试剂盒(北京天根生化公司)，Superscript III cDNA合成试剂盒(Invitrogen公司)，Trizol裂解液(Invitrogen公司)，地塞米松(Sigma公司)。

1.2 骨髓间充质干细胞分离、培养与鉴定

骨髓单个核细胞分离于小鼠股骨骨髓腔，分离后检测CD44、CD34、CD90、CD29细胞表面标志，同时结合细胞多向分化鉴定BMSCs[13]。

1.3 实验分组

实验共分为4组：A组(常氧条件下培养)；B组(1% O2条件下培养)；C组(常氧培养条件下添加10-9mol/L OGP)；D组(1%O2条件下添加10-9mol/L OGP)。根据既往实验，本研究选择1% O2与 10-9mol/L OGP作为干预浓度[10]。实验均采用成脂肪诱导细胞培养基(含10%胎牛血清的低糖DMEM+10-6mol/L+0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤+10 μg/mL胰岛素+100 μg/mL吲哚美辛)。

1.4 ELISA法检测HIF-1α的表达

培养1 d后收集细胞上清液测定蛋白浓度，采用双抗体夹心法检测HIF-1α，最后在450 nm处检测光密度值。具体实验方法依照课题组既往实验步骤进行法检测[10]。HIF-1α检测结果以pg/mg总蛋白表示。

1.5 油红O染色

弃培养液，用1×PBS洗涤2次，中性甲醛固定30 min；随后加入油红O染液染色30 min，最后镜下观察脂滴。随机选取5个高倍视野，计数阳性细胞，统计学处理。

1.6 实时荧光定量PCR检测

培养14 d后收集细胞，随后RNA提取及反转录合成cDNA。引物序列见表1，扩增反应条件为95 ℃变性2 min，40个循环(95 ℃ 15 s，54 ℃ 30 s，65 ℃ 20 s)。β-actin作为内参，目的基因表达量以2-ΔΔCt法进行相对定量分析，将A组各基因表达量设定为1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.7 Western blot检测

14 d后收集细胞，每组取等量蛋白进行电泳转膜，5% 牛血清白蛋白封闭2 h，加入抗PPARγ(1∶1 000)及抗C/EBPα (1∶1 000)单克隆抗体4 ℃孵育过夜，随后二抗GAPDH 抗体(1∶2 000)37 ℃孵育2 h；GAPDH 为内参蛋白。目的蛋白与内参蛋白灰度值比值作为目的蛋白相对表达量。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 ELISA检测

A组与C组几乎未能检测到HIF-1α蛋白表达。与A组对比，B组与D组能明显上调HIF-1α蛋白的表达(P<0.01)；B组与D组HIF-1α蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 油红O染色分析

油红O染色将脂肪染成红色。A组可见大量含脂滴的阳性细胞，B组与C组细胞脂滴生成减少，D组细胞脂滴生成明显减少。B组、C组及D组与A组相比，B组、C组及D组脂肪滴形成明显减少(P<0.01)；B组与C组相比，脂肪滴形成差异无统计学意义(P>0.05)；与B组及C组相比，D组脂肪滴形成明显减少(P<0.01)。见图1及图2。

图1 各组细胞培养14 d油红O染色图片Fig.1 Oil red O staining observation at 14d of culture in each group注：A：A组，B：B组，C：C组，D：D组。

图2 脂肪滴形成细胞数Fig.2 The lipid positive BMSCs注：与A组相比，*P<0.01；与D组相比，△P<0.01。

2.3 实时荧光定量PCR分析

培养14 d后，低氧环境及成骨生长肽均能明显降低PPARγ与C/EBPα mRNA的表达。与A组相比，B组、C组及D组中PPARγ与C/EBPα mRNA的表达明显下调(P<0.01)；B组与C组相比差别无统计学意义(P>0.05)；与B组及C组相比，D组PPARγ与C/EBPα mRNA表达明显降低(P<0.01)。见图3。

图3 PPARγ mRNA与C/EBPα mRNA表达水平的qPCR分析Fig.3 The mRNA expression of PPARγ and C/EBPα detected with qPCR注：与A组相比，*P<0.01；与D组相比，△P<0.01。

2.4 Western blot分析

Western blot检测显示，培养14 d后，低氧环境及成骨生长肽均能明显降低PPARγ与蛋白水平的表达。与A组相比，B组、C组及D组中PPARγ与C/EBPα 蛋白表达明显下调(P<0.01)；B组与C组差别无统计学意义(P>0.05)；与B组及C组相比，D组PPARγ与C/EBPα 蛋白表达降低(P<0.01)。见图4。

3 讨论

低氧适应性反应由hypoxia inducible factor (HIF)介导，在包括红细胞生成、新生血管生成、血管舒张、无氧代谢等多方面发挥重要作用。HIF-α包括HIF-1α与HIF-2α[10]。α亚基是功能亚基，在常氧条件下不稳定，因此不能检出[10,14-15]。本实验中ELISA法检测到B组与D组培养24 h后HIF-1α蛋白表达明显上调，而C组与D组未能检测到HIF-1α蛋白的表达。表明我们实验中采用1%的O2能引起低氧适应性反应。

图4 PPARγ与C/EBPα 蛋白表达水平的Western-blot分析Fig.4 The protein expression of PPARγ and C/EBPα detected with western-blot注：与A组相比，*P<0.01；与D组相比，△P<0.01。

越来越多的研究表明HIF在干细胞的定向分化中发挥着重要作用，包括成肌分化、成骨分化、成神经分化、成软骨分化、成肌腱定向分化等[16-18]。课题组前期研究已经表明1%低氧培养能促进BMSCs成骨分化，而关于低氧环境对BMSCs成脂肪分化影响的研究相对较少，且不同研究结论并不一致。Park等[11]研究表明1%O2培养通过HIF-1α依赖的方式阻止GSK3β入核及C/EBP与DNA结合能力，从而阻止3T3-L1细胞的成脂肪分化。Camacho-Cardenosa等[19]的研究表明在(17.2±0.3)% FiO2下12周高强度间歇训练比正常氧环境中(20.9% FiO2)12周高强度间歇训练更能降低肥胖女性减少脂肪含量，同时增加肌肉含量。Wagegg等[12]的研究表明2%O2培养环境能以HIF依赖的方式抑制干细胞成脂肪分化而促进成骨分化。Wang等[20]的研究发现间歇低氧，即每个循环1%O210 min随后21% O25 min，能促进脂肪前体祖细胞向脂肪细胞的分化。伍志伟等[21]的研究发现3%、6%、12%、20% O2培养均能促进骨髓间充质干细胞的成脂肪分化。Jiang等[22]研究发现0.2%的低氧环境培养通过上调HIF-1α和C/EBP表达，促进间充质干细胞的成脂分化。Weiszenstein等[23]的研究发现4%的低氧环境明显促进小鼠3T3-L1细胞脂滴形成和成脂分化，而1%低氧环境减少细胞脂滴聚集并抑制成脂分化。本实验结果表明1% O2培养能够明显减少细胞中脂滴的形成及下调成脂肪分化相关转录因子PPARγ和C/EBPαmRNA和蛋白水平的表达，抑制小鼠骨髓间充质干细胞成。笔者推测不同研究中低氧对间充质干细胞成脂分化作用不一致，可能与不同实验中低氧的浓度不同、低氧的给养方式及不同的细胞种类有关。这需要下一步对上述不同因素进行对比研究以确定相关不同因素的影响作用。

成骨生长肽是一种内源性多肽。已经有大量的体外研究表明OGP能促进成骨前体细胞的成骨分化，显示出其在骨质疏松症治疗中的潜在作用靶点[24-25]；同时也有研究[5-6]表明OGP与支架材料复合后能增强支架材料的骨诱导性能，促进骨组织的修复。Chen等[7]研究发现OGP不仅能促进BMSCs成骨分化，同时也能明显抑制其成脂分化。本研究表明在体外OGP能明显减少BMSCs脂滴的形成，同时下调PPARγ和C/EBPα的表达，抑制小鼠骨髓间充质干细胞成脂肪分化，且与低氧环境对BMSCs成脂分化抑制具有协同作用。

BMSCs能够定向分化为多种终末细胞。越来越多的研究[1,4]表明MSCs成骨成脂分化失衡是骨质疏松症发病的重要机制之一。间充质干细胞的成脂分化受到信号通路的调控，其中PPARγ和C/EBPα是间充质干细胞成脂分化中最为重要的转录因子，能够诱导脂肪细胞关键基因的表达，是终末脂肪细胞形成所必须的[26-27]。本实验结果显示，1%O2与OGP均能明显抑制PPARγ和C/EBPα mRNA和蛋白水平的表达，表明二者均能抑制干细胞的成脂分化。同时，课题组前期研究已经表明低氧及OGP均能明显促进间充质干细胞的成骨分化[10]，因此笔者认为低氧与OGP在包括骨质疏松症在内的成骨成脂分化失衡等脂代谢紊乱疾病中具有良好的临床应用前景。但是，目前尚未见到关于OGP对BMSCs成脂分化影响相关分子机制的报道，而关于低氧对BMSCs成脂分化影响相关分子机制报道也相对较少。Wang等[28]的研究表明低频间歇低氧可能是通过巨噬细胞极化导致小鼠皮下脂肪组织的成脂肪分化能力降低。Wang等[20]的体外研究表明低频间歇低氧是通过激活(IGF-1R)/Akt信号通路而促进脂肪前体细胞的成脂肪分化。

综上，本实验研究发现1%O2环境培养与OGP均能明显抑制间充质干细胞的成骨分化，且二者联合应用时具有协同效应，对间充质干细胞具有更强成脂肪分化抑制作用。但是目前关于低氧与OGP对BMSCs成脂分化影响的分子机制并不清楚，我们下一步将就OGP与低氧对BMSCs成脂分化影响的相关分子机制进行研究。