姜自鹏　赵会纳　苑广迪　蒋彩虹　刘旦　余世洲 雷波　程立锐　杨爱国　付宪奎

摘  要：为明确烟草株高和叶数性状的遗传规律，发掘控制相关性状的主效位点，以台烟8号（TT8）为母本（P1），NC82为父本（P2），配置杂交组合，以TT8为轮回亲本回交，构建了包含200个单株的BC1F1群体。在此基础上，分别在四川、山东两个环境点种植群体材料，获得株高和叶数表型，进而利用高密度遗传图谱对株高和叶数性状进行QTL定位分析。结果表明，在两个环境条件下共定位到4个与株高和叶数相关的主效QTL，每个QTL均可以解释相应性状10%～20%的表型变异。两个环境点定位到2个叶数性状QTL，均位于23号连锁群上，非等位;定位到3个株高性状主效QTL，四川点1个位于23号连锁群上，山东点2个分别位于21号和23号连锁群上，其中山东点23号连锁群上的主效位点与控制叶数的主效QTL遗传位置一致。相关结果为进一步克隆控制株高和叶数性状的主效基因及烟草重要农艺性状分子改良奠定了基础。

关键词：株高;叶数;遗传图谱;QTL定位;候选基因预测

QTL Mapping and Prediction of Candidate Genes for Plant Height and Leaf Number in Tobacco

JIANG Zipeng  ZHAO Huina YUAN Guangdi JIANG Caihong  LIU Dan YU Shizhou

LEI Bo CHENG Lirui YANG Aiguo  FU Xiankui

Abstract：In order to clarify the genetic rules of plant height and leaf number traits of tobacco and explore the main effective loci controlling related traits， a BC1F1 population containing 200 individual plants was constructed by using Taiyan 8 （TT8） as the female parent （P1） and NC82 as the male parent （P2）， and backcrossing TT8 as recurrent parent. The plant height and leaf number phenotypes were obtained by planting population materials in Sichuan and Shandong respectively. And then QTL mapping for plant height and leaf number traits was performed based on the high-density genetic map. The results showed that four major QTLs related to plant height and leaf number were located under two environmental conditions， which could explain 10%-20% of the phenotypic variation of the corresponding trait. At two environmental sites， two QTLs for leaf number traits were mapped， which were non-allelic and located on the 23 linkage group; three major QTLs for plant height traits were identified， including one in Sichuan was located on the 23 linkage group and two in Shandong were located on the 21 and 23 linkage groups respectively. The major loci of plant height located on the 23 linkage group in Shandong is consistent with that of the major QTL of leaf number. The related studies laid a foundation for further cloning the major genes controlling plant height and leaf number traits and molecular improvement of important agronomic traits in tobacco.

Keywords： plant height; leaf number; genetic map; QTL mapping; prediction of candidate genes

株高和葉数是烟草重要的农艺性状，与烟草的产量和品质有紧密的联系^[1-3]。因此，要提高烟叶的产量和品质，就必须对其相关性状进行改良。烟草基本农艺性状、抗性和品质等重要性状大多都属于复杂数量性状^[4-5]，受多基因控制，易受环境影响。烟草是一个典型的大植物基因组^[6]，基因组大小有4.5 Gb，其中重复序列含量达到基因组序列的60%～80%，不同种质间遗传差异较小，这极大限制了烟草数量性状遗传研究。

目前，关于烟草株高和叶数性状QTL定位分析虽有报道，但大多是基于低质量的烟草遗传图谱进行的，这可能导致获得的QTL数量较少、准确度和精细度低，影响烟草株高和叶数性状的分子改良。蔡长春等^[7]利用仅含23个连锁群的不完整的遗传连锁图谱检测到1个与叶数相关的QTL。李茜^[8]利用SSR和SRAP标记技术构建遗传连锁图谱，检测到2个与叶数相关的QTL均位于16和17号连锁群上，3个与株高相关的QTL分别位于2、17和19

号连锁群。童治军等^[9]基于SSR标记的遗传图谱定位到了13个与株高相关的QTL、10个与叶片数相关的QTL，但大部分效应值较小，难以在生产中得到有效利用;之后又利用重组自交系群体构建了一张包含626个SSR标记的遗传连锁图谱，发现了5个与叶片数相关QTL，分别分布于第3、4、7、17、和22号连锁群上，6个与株高相关的QTL分别分布于3、7、13、14、17、和24号连锁群上，均具有较高的效应值，为培育高产烟草新品种提供了理论依据^[10]。

基于限制性酶切位点DNA测序（Restriction-site associated DNA sequencing，RAD-seq）是在第二代测序基础上发展而来的一项基于全基因组酶切位点的简化基因组测序技术^[11]。RAD-seq测序技术具有标记数量高，准确性高、数据利用率高等优点，被广泛应用于高密度遗传图谱的构建、高密度单核苷酸多态性（SNP）标记开发，植物重要性状的QTL定位等研究^[12-13]，解决了利用传统的分子标记很难覆盖全基因组的问题。

本研究组前期以RAD-seq技术构建了高密度遗传图谱^[14]，在此基础上，本文以TT8为母本，NC82为父本，配置杂交组合F1，F1回交于TT8，得到由200个子代组成的BC1F1群体，对与烟草产量和品质相关的株高和叶数两个重要性状进行QTL定位分析，并对候选基因进行预测，以期为今后进一步研究株高和叶数性状分子育种及开展烟草重要农艺性状分子改良提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  供试材料与试验设计

本试验以TT8为母本（P1），以NC82为父本（P2）。其中NC82是美国烤烟类型品种，TT8为我国培育的烤烟品种，两品种在株高和叶数农艺性状中表现有显著差异。两者均由中国农业科学院烟草研究所提供。

2016年3—9月，在中国农业科学院烟草研究所青岛试验基地利用TT8与NC82杂交获得F1种子;2017年3—9月，在青島试验基地利用F1回交TT8获得BC1F1群体种子。2018年分别在中国农业科学院烟草研究所诸城试验基地和中国农业科学院烟草研究所西南试验基地种植200个BC1F1群体。为了获得稳定、可靠的数据，将每个BC1F1单株利用组织快繁50株，用于田间种植。田间种植设2个重复，每个材料每重复种植10株，株距50 cm，行距120 cm，按当地优质烟生产技术措施进行栽培管理。每个重复随机调查5个单株，取平均值。

1.2  表型调查

烟草株高和叶数的测定按照YC/T142—2010《烟草农艺性状调查方法》要求进行。

1.3  数据统计与分析

采用Excel 2019软件，对200个BC1F1材料的株高和叶数性状进行整理和统计性分析。

1.4  QTL定位分析

利用本研究组前期以母本TT8、父本NC82、F1以及200个BC1F1群体构建的烟草遗传图谱^[14]，结合株高和叶数的田间表型数据，利用QTL IciMapping 4.2软件，利用ICIM-ADD作图方法对烟草株高和叶数性状进行QTL定位，设置阈值为2.5，若在SNP标记中检测到LOD大于或等于2.5，则认为该处存在QTL。按照MCCOUCH^[15]等规则进行QTL的命名。使用Mapchart 2.2绘制遗传图谱。

1.5  株高和叶数性状相关候选基因预测

根据QTL定位的结果，利用中国烟草基因组数据库（http：//218.28.140.17/）注释目标区段内的基因功能，查阅可能与叶数和株高性状相关的基因，进行候选基因预测。

2  结  果

2.1  株高和叶数性状表型分析

在两个环境条件下，亲本和BC1F1群体的株高和叶数性状表型值如表1所示，在BC1F1群体中，不同株系间株高和叶数差异显著，表现为连续性变异。在四川点，叶数的变异幅度为11～20.50片，平均16.04片，株高的变异幅度为142.06～193.57 cm，平均161.95 cm;在山东点，叶数的变异幅度为15.61～26.36片，平均为22.38片，株高的变异幅度为53.75～185 cm，平均126.52 cm;两性状的平均值均介于双亲之间，且存在双向超亲个体。株高和叶数性状变异系数在3.90%～9.70%之间，说明BC1F1群体中两性状存在较大的分离。统计两个地点株高

和叶数性状的偏度和峰度发现，偏度的绝对值在0.35～0.98之间，峰度的绝对值在4.60～10.66之间，符合单峰正态分布的特征，表明株高和叶数属于数量性状。方差分析表明（表2），烟草株高和叶数性状在不同基因型之间均存在显著差异，在不同的环境和基因型与环境互作中也存在显著差异。

2.2  株高和叶数性状QTL定位分析

本研究针对株高和叶数两个性状进行全基因组QTL扫描，共检测到4个QTL（表3，图1），分别分布在第21和第23号连锁群上。

在四川和山东试验基地检测到与叶数相关的QTL各1个，分别命名为qLN23-1和qLN23-2。四川点qLN23-1位于23号连锁群maker69553-maker76610标记之间，可解释19.34%的遗传变异;山东点qLN23-2位于23号连锁群标记maker45399-maker47428标记之间，可解释总表型变异的14.81%。虽然两个环境点在23号连锁群上都可以定位到一个控制叶数的主效QTL，但两个QTL所在遗传位置差距较大，不是同一主效位点。

检测到与株高相关的QTL有3个，分别命名为qPH23-1、qPH23-2和qPH21。在四川和山东试验基地检测到的qPH23-1和qPH23-2均分布在23号连锁群上，qPH23-1位于标记maker9429和标记maker222554之间，可解释19.76%的表型遗传变异;qPH23-2位于标记maker45399和标记maker47428之间，可解释总表型变异的19.99%，两者位置相近;同时，位于山东点23号连锁群上控制株高（qPH23-2）和叶数性状（qLN23-2）的主效位点的位置一致。除此之外，在山东试验基地还检测到一个QTL（qPH21）位于21号连锁群上，位于标记maker17152和标记maker1243之间，可解释10.46%的表型遗传变异。

2.3  预测候选基因

根据QTL定位和分析的结果，位于23号连锁群上的主效位点存在一因多效，可能与叶数和株高性状紧密相关。因此，在中国烟草基因组数据库（http：//218.28.140.17/）网站中以该主效位点所对应的红花大金元参考基因组的物理位置进行候选基因的筛选。如表4所示，目标区间内共有15个编码基因，注释功能为E3泛素蛋白连接酶、bHLH68转录因子、核孔复合体蛋白、膜结合酰基转移酶C24H6.01c、肽/硝酸盐转运体、MYB86转录因子、类转座子蛋白、疏水蛋白RCI2B、生长素诱导蛋白等等。其中Ntab0789630编码与拟南芥bHLH68转录因子功能相似的蛋白，与侧根的发育、胚轴的伸长和调控不同生理过程有关^[16-19];Ntab0035030与拟南芥MYB转录因家族MYB86相似，与黄酮类物质含量和花青素积累有关^[20-22];Ntab0702260与拟南芥生长素诱导蛋白SAUR71相似，在細胞生长、根分生组织发育和生长素运输中起到调节作用^[23]。因此，初步将Ntab0789630和Ntab0702260确定为控制烟草株高和叶数关键候选基因。

3  讨  论

3.1  株高和叶数性状的QTL定位及候选基因分析

本研究利用200个BC1F1群体分别在四川、山东两个环境点评价群体材料的株高和叶数性状，获得稳定、可靠表型，进而利用构建的高密度的遗传图谱对株高和叶数性状进行全基因组QTL定位分析，共检测到4个与株高和叶数相关的主效QTL。本研究获得的叶数性状的主效QTL位于23号连锁群上，控制株高性状的主效QTL位于21和23号连锁群上，均是新发现的QTL位点，均可以解释10%以上的表型变异，研究结果具有真实性和可信度。山东点位于23号连锁群上控制株高和叶数性状的主效位点的位置一致，说明这个位点具有一因多效的作用。但是，本研究的结果与李茜^[8]和童治军等^[10]报道的结果不一致，说明在不同种质资源中存在着多个控制株高和叶数性状的非等位主效位点。

针对我们定位到的控制株高和叶数的主效位点，初步开展了候选基因预测。在目标区间内，预测了2个控制烟草株高和叶数性状的关键候选基因。植物株高和叶数性状的发育与细胞的分裂和生长过程有关，同时受多种植物激素的调控。bHLH68转录因子通过参与脱落酸（ABA）的调控表达从而影响植物的器官发育和抗旱性^[17]。bHLH （Basic helix-loop-helix）转录因子家族是最大的基因家族之一，bHLH通过自身特定的功能域与靶基因相互识别并作用，进而通过代谢信号通路调控相关基因的表达在调控植物生长发育、逆境胁迫和次生代谢等过程中起关键作用^[24-27]。SAUR71是生长素应答基因家族SAUR的一种调控因子，在细胞增殖和扩张过程中起作用，可能参与调控植物株高和叶片数的发育过程。因此，根据定位结果及候选基因分析，初步确定Ntab0789630和Ntab0702260为候选基因，相关功能验证正在开展中。

3.2  株高和叶数性状在育种改良上的应用

利用BC1F1群体和高密度遗传连锁图谱，我们定位到了4个与株高和叶数相关的QTL，为今后进一步挖掘相关的候选基因和烟草改良奠定了基础。烟草的各个植物学性状的综合表现与它们之间复杂的相关性、遗传控制和环境效应均有直接或间接的关系。童治军等^[28]和朱惠琴等^[29]对烟草各农艺性状的研究表明，株高、叶数、节距、叶长、叶宽等农艺性状间具有显著的相关性。WHITE等^[30]和殷英等^[31]的研究结果表明，烟草产量和叶片数、株高有较高的正相关。因此，本研究发掘的控制株高和叶数的主效QTL及紧密连锁的分子标记，可为烟草重要农艺性状改良提供可操作的遗传单元，同时对培育优质、适产新品种也有一定意义。

4  结  论

本研究基于高密度的遗传连锁图谱，结合200个BC1F1群体在两环境下的表型，共挖掘到4个与株高和叶数性状有关的QTL，根据QTL定位和分析的结果，对候选基因进行了预测，为今后进一步开展烟草株高和叶数性状的主效基因克隆及分子育种奠定基础。

参考文献

• 卢晓环，周志强，李海灵，等. 玉米株高qPH10的QTL定位及候选基因预测[J]. 玉米科学，2020，28（1）：37-44.

LU X H， ZHOU Z Q， LI H L， et al. QTL mapping and candidate gene prediction of maize plant heightqPH10[J]. Journal of Maize Sciences， 2020， 28（1）： 37-44.

• PEIFFER J A， ROMAY M C， GORE M A， et al. The genetic architecture of maize height[J]. Genetics， 2014， 196（4）： 1337-1356.
• 王日新，任民，張兴伟，等. 普通烟草栽培种内株高性状主基因加多基因遗传分析[J]. 中国烟草科学，2009，30（2）：15-20.

WANG R X， REN M， ZHANG X W， et al. Genetic analysis of plant height using mixed major gene plus polygenes inheritance model in culture spawn ofNicotiana Tabacum L[J]. Chinese Tobacco Science， 2009， 30（2）： 15-20.

• 王跃金，彭博，鹿晋珲，等. 楚雄烟叶生产高质量发展现状与对策[J]. 安徽农学通报，2019，25（9）：49-52.

WANG Y J， PENG B， LU J H， et al. The status and countermeasures of the high-quality development in chuxiong tobacco[J]. Anhui Agricultural Science Bulletin， 2019， 25（9）： 49-52.

• 徐良，权锡鉴，牛柱峰，等. 日照现代烟草农业发展现状与对策[J]. 中国烟草科学，2014，35（6）：65-69.

XU L T， QUAN X J， NIU Z F， et al. The current situation and strategies of modern tobacco agricultural development in rizhao[J]. Chinese Tobacco Science， 2014， 35（6）： 65-69.

• 王元英. 烟草基因组知识篇：1. 基因组与烟草基因组计划[J]. 中国烟草科学，2010，31（1）：81-82.

WANG Y Y. Knowledge of tobacco genome. 1. genome and tobacco genome project[J]. Chinese Tobacco Science， 2010， 31（1）： 81-82.

• 蔡长春，邓环，冯吉，等. 烤烟生育期相关性状的初步遗传分析[J]. 中国烟草学报，2014，20（6）：70-77，84.

CAI C C， DENG H， FENG J， et al. Preliminary genetic analysis of relevant traits in flue-cured tobacco at growth and development period[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2014， 20（6）： 70-77， 84.

• 李茜. 烟草遗传图谱构建与农艺性状和化学成分的QTL定位[D]. 重庆：西南大学，2015.

L X. Construction of linkage genetic map and qtl mapping for agronomic characters and chemical quality traits in tobacco[D]. Chongqing： Southwest University， 2015.

• 童治军，焦芳婵，吴兴富，等. 烤烟6个农艺性状的QTL定位[J]. 作物学报，2012，38（8）：1407-1415.

TONG Z J， JIAO F C， WU X F， et al. Mapping of quantitative trait loci underlying six agronomic traits in flue-cured tobacco （Nicotiana tabacumL.）[J]. Acta Agronomica Sinica， 2012， 38（8）： 1407-1415.

• 童治军，焦芳婵，陈学军，等. 7个烤烟产量相关性状的QTL定位分析[J]. 西北植物学报，2018，38（7）：1235-1243.

TONG Z J， JIAO F C， CHEN X J， et al. Mapping of quantitative trait loci underlying seven yield-related traits in flue-cured tobacco （Nicotiana tabacumL.） [J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica， 2018， 38（7）： 1235-1243.

• 胡亚亚，刘兰服，冀红柳，等. 简化基因组测序技术研究进展[J]. 江苏师范大学学报，2018，36（4）：63-68.

HU Y Y， LIU L F， JI H L， et al. Research progress on the reduced-representation genome sequencing technique[J]. Journal of Jiangsu Normal University， 2018， 36（4）： 63-68.

• HARVEY M G， SMITH B T， GLENN T C， et al. Sequence Capture versus Restriction Site Associated DNA Sequencing for Shallow Systematics[J]. Systematic Biology， 2016， 65（5）： 910-924.
• ZHANG D F， XIA T， FAN G H， et al. Investigation of Chinese wolfberry （Lycium spp.） germplasm by restriction site-associated DNA sequencing （RAD-seq） [J]. Biochemical Genetics， 2018， 56（6）： 575-585.
• CHENG L R， CHEN X C， JIANG C H， et al. High-density SNP genetic linkage map construction and quantitative trait locus mapping for resistance to cucumber mosaic virus in tobacco （Nicotiana tabacum L.） [J]. Acta Agronomica Sinica， 2019， 7（4）： 539-547. 
• MCCOUCH S R， CHO Y， YANO M， et al. Report on QTL nomenclature [J]. Rice Genet Newsl， 1997， 14： 11-13.
• HAO Y， ZONG X M， REN P， et al. Basic Helix-Loop-Helix （bHLH） Transcription Factors Regulate a Wide Range of Functions in Arabidopsis[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2021， 22（13）： 7152.
• LE HIR R， CASTELAIN M， CHAKRABORTI D， et al. AtbHLH68 transcription factor contributes to the regulation of ABA homeostasis and drought stress tolerance in Arabidopsis thaliana[J]. Physiologia Plantarum， 2017， 160（3）： 312-327.
• YANG C W， HUANG S， ZENG Y， et al. Two bHLH transcription factors， bHLH48 and bHLH60 associate with phytochrome interacting factor 7 to regulate hypocotyl elongation in Arabidopsis[J]. Cell Reports， 2021， 35（5）： 109054.
• WANG W S， ZHU J， LU Y T. Overexpression of AtbHLH112 suppresses lateral root emergence in Arabidopsis[J]. Functional Plant Biology， 2014， 41（4）： 342-352.
• Ye J H， Lv Y Q， Liu S R， et al. Effects of Light Intensity and Spectral Composition on the Transcriptome Profiles of Leaves in Shade Grown Tea Plants （Camellia sinensis L.） and Regulatory Network of Flavonoid Biosynthesis[J]. Molecules， 2021， 26（19）： 5836.
• DUBOS C， STRACKE R， GROTEWOLD E， et al. MYB transcription factors in Arabidopsis[J]. Trends in Plant Science， 2010， 15（10）： 573–581.
• GAO X， WANG L D， ZHANG H， et al. Transcriptome analysis and identification of genes associated with floral transition and fruit development in rabbiteye blueberry （Vaccinium ashei）[J]. PLos One. 2021， 16（10）： e0259119.
• QIU T， CHEN Y， LI M M， et al. The tissue-specific and developmentally regulated expression patterns of the SAUR41 subfamily of small auxin up RNA genes： potential implications[J]. Plant Signal Behav， 2013， 8（8）： e25283.
• 馬彦军，谢军，马瑞，等. NaCl胁迫下黑果枸杞bHLH转录因子家族鉴定与生物信息学分析[J]. 中草药，2020，51（20）：5311-5319.

MA Y J， XIE J， MA R， et al. Identification and bioinformatics analysis of bHLH transcription factor gene family inLycium ruthenicumMurr under NaCl stress[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs， 2020， 51（20）： 5311-5319.

• WANG J Y， HU Z Z， ZHAO T M， et al. Genome-wide analysis of bHLH transcription factor and involvement in the infection by yellow leaf curl virus in tomato （Solanum lycopersicum） [J]. BMC Genomics， 2015， 16（1）： 1-14.
• DAS A K. bHLH转录因子ABP7-Like在玉米叶片和籽粒发育中的功能鉴定和分子机制分析[D]. 北京：中国农业科学院，2019.

DAS A K. Functional characterization and molecular mechanism analysis of ABP7-Like， a bHLH transcription factor in maize leaf and kernel development[D]. Beijing： Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences， 2019.

• FAN M， BAI M Y， KIM J G， et al. The bHLH transcription factor HBI1 mediates the trade-off between growth and pathogen-associated molecular pattern-triggered immunity in Arabidopsis[J]. The Plant Cell， 2014， 26（2）： 828–841.
• 童治军，方敦煌，陈学军，等. 6个烟草重要产量相关性状的遗传分析[J]. 中国烟草学报，2020，26（5）：72-81.

TONG Z J， FANG D H， CHEN X J， et al. Genetic analysis of six important yield-related traits in tobacco[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2020， 26（5）： 72-81.

• 朱惠琴，张宪银，薛庆中. 烟草两个DH群体农艺性状的遗传分析[J]. 浙江大学学报，2004，30（5）：477-481.

ZHU H Q， ZHANG X Y， XUE Q Z. Genetic analysis of agronomic traits of two doubled haploid populations in tobacco[J]. Journal of Zhejiang University， 2004， 30（5）： 477-481.

• WHITE F H， PANDEYA R S， DIRKS V A. Correlation studies among and between agronomic， chemical， physical and smoke characteristics in ?ue-cured tobacco （Nicotiana Tabacum L.） [J]. Canadian Journal of Plant Science， 1979， 59（1）： 111-120.
• 殷英，张玉，余祥文，等. 烤煙主要农艺性状与产量产值的关系研究[J]. 中国烟草科学，2012，33（6）：18-22.

YIN Y， ZHANG Y， YU X W， et al. Relationships among main agronomic attributes and yields and output value of flue-cured tobacco[J]. Chinese Tobacco Science， 2012， 33（6）： 18-22.

基金项目：中国烟草总公司科技重大专项项目（110202001027）;中国农业科学院科技创新工程（ASTRP-TRI01）

作者简介：姜自鹏（1994-），女，在读硕士研究生，主要研究领域：分子育种。E-mail：jiangzipeng59@163.com。*通信作者，E-mail：fuxiankui@caas.cn

收稿日期：2021-08-23                 修回日期：2022-02-15