温伊蕾,刘国平,丁丽燕

(中山市疾病预防控制中心，广东 中山 528403)

亚硝酸盐和硝酸盐是自然界中普遍存在的含氮无机化合物。硝酸盐的重要来源是由自然界中的氮循环以及人类的活动所构成。在其形成的过程中，由于微生物的作用，常伴有亚硝酸盐的产生。常见的亚硝酸盐主要有亚硝酸钠和亚硝酸钾，外观与食盐类似，呈白色至淡黄色，粉末或颗粒状，无臭，味微咸，易潮解和溶于水，因其独特的化学属性常被作为食品的添加剂、防腐剂和发色剂，广泛应用于食品加工中。一般情况下，人体中的亚硝酸盐主要是食物和饮水中的硝酸盐在口腔及胃中细菌的作用下转化而来[1]。亚硝酸盐还可以通过一定途径被还原为一氧化氮。摄入含有低水平亚硝酸盐的食物可补充人体内的亚硝酸盐。但由于其物理性质与食盐相类似，日常管理不善和使用不当导致误食中毒事件时有发生。人摄入0.3～0.5 g亚硝酸盐即可引起中毒，一次性食入超过3 g则可导致死亡[2]。人体摄入亚硝酸盐后，体内过量的亚硝酸盐可使血液中二价铁离子氧化为三价铁离子，使正常血红蛋白转化为高铁血红蛋白，失去携氧能力，引起组织缺氧，发生中毒[3]。亚硝酸盐中毒的潜伏期长短不等，视摄入亚硝酸盐的数量、浓度而定。一般潜伏期为1～3小时，长者可达1～2天，短者仅10分钟左右。通常中毒表现为发绀(皮肤或粘膜呈现青紫色)、胸闷、呼吸困难、呼吸急促、头晕、头痛、心悸等。中毒严重者还可出现恶心、呕吐、心率变慢、心律不齐、烦躁不安、血压降低、肺水肿、休克、惊厥或抽搐、昏迷，最后可因呼吸、循环衰竭而死亡[4]。马岩、王霄晔等的研究表明[5]，近年来在全国性化学食物中毒事件中，由误食误用亚硝酸盐而引发的食物中毒事件占所有化学性食物中毒事件的比例高达50%。

目前，常用的食品中亚硝酸盐检测方法有分光光度法、离子色谱法、荧光法、电化学法、化学发光法、示波极谱法等[4-12]，而国家标准对日常食品中亚硝酸盐限量和检测方法都有了相应的规定。但是各方法都存在一定的局限性，其中分光光度法在日常检测过程中亚硝酸盐含量较大时,过量的亚硝酸盐对耦合反应产生影响，使耦合的组分发生氧化、硝化反应，容易出现褪色现象。在中毒事件发生时，往往样品的亚硝酸盐含量都比较大，容易造成结果的误判。离子色谱法也存在操作步骤繁琐，干扰因素多，检测范围窄等缺点[6]。荧光法对环境因素较敏感,干扰因素较多且由于发生荧光强度的物质较少,此方法应用范围较窄[7-8]。电化学法对于电极的选择及电极表面的修饰材料要求较严苛,实验方法不稳定性大[9]。化学发光法则需要高燃烧温度来保持一氧化氮的存在，且气相化学发光法检测对于还原剂的强度有很大的选择性要求[10]。示波极谱法分析技术后样品的峰型复杂，需要耗时分析，影响检测时效[4]。因此，在食物中毒事件中的检测采用快速定性和定量方法，对临床救治、保障人民群众生命安全以及监督管理工作有着十分重要的意义。

本文研究利用在酸性条件下亚硝酸盐与环己基氨基磺酸钠作用生成环己基氨基磺酸酯，建立食品中亚硝酸盐气相色谱测定方法，为日常食品检测和食物中毒事件检测提供一种快速、灵敏、准确的方法。

1 材料与方法

1.1 仪 器

6890N气相色谱仪，安捷伦公司；FID检测器，安捷伦公司；石英毛细管柱HP-5(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，安捷伦公司；Milli-Q Advantage A10超纯水仪，美国密理博公司；AB265-S电子天平(感量0.0001g)，瑞士METTLER TOLEDO 公司；G560E 涡旋混合器，美国SCIENTIFIC INDUSTRIES 公司。

1.2 试 剂

环己基氨基磺酸钠(纯度>98%)，TCI化成工业发展有限公司；浓硫酸(分析纯)，广州化学试剂厂；正己烷(色谱纯)，美国默克公司；氯化钠(分析纯)，天津市光复科技发展有限公司；乙酸锌(分析纯)，广州化学试剂厂；亚铁氰化钾(分析纯)，广州化学试剂厂；硼砂(分析纯)，广州化学试剂厂。

1.3 色谱条件

色谱柱：HP-5毛细管柱，30 m×0.32 mm×0.25 μm；温度：进样口200 ℃，检测器250 ℃；柱温：80 ℃恒温；空气：400 mL/min;氢气：40 mL/min；载气：高纯N2，恒流30 mL/min；进样方式：分流进样，分流比20:1；进样体积：1.0 μL。

1.4 试验方法

1.4.1 方法原理

在硫酸介质中，样品中的亚硝酸盐与环己基氨基磺酸钠生成环己醇亚硝酸酯，经正己烷提取后，用带FID检测器的气相色谱仪进行定量分析。

1.4.2 样品处理方法

将样品放置到匀浆机中进行打碎，取5 g样品放入三角瓶中，再加纯水25 mL充分振摇混匀，经过过滤，将滤液置入50 mL带盖离心管中，再把带盖离心管放置入冰浴5 min后，迅速把5 mL正己烷、2.5 mL环己基氨基磺酸钠、2.5 mL硫酸溶液准确加入离心管后，盖紧、摇匀并在冰浴中放置30 min，后加入2.5 g氯化钠振摇，离心取上清液冷藏备用。

1.4.3 标准曲线

分别吸取适量的亚硝酸盐标准溶液于6个10 mL容量瓶中，用适量的超纯水配制成0，5.00 μg/mL，10.0 μg/mL，20.0 μg/mL，80.0 μg/mL，100.0 μg/mL(相当于0，50 μg，100 μg，200 μg，800 μg，1000 μg亚硝酸钠)，同样品相同步骤衍生化后，上机检测。

2 结果讨论

2.1 线性范围和检出限

将标准系列溶液按照本方法色谱条件进行测定，亚硝酸盐衍生后生成的环己醇亚硝酸酯的保留时间为3.036 min(图1)。本方法在0～1000 μg线性范围内线性关系良好(图2)，相关系数0.9993，回归方程Y=0.09232X-0.7558，检出限为0.70 μg。若取样5 g样品，测得亚硝酸盐的最低检出浓度为0.14 mg/kg。因国标GB 5009.33-2016中的分光光度法通过笔者研究发现，在亚硝酸盐含量大于500 μg时，过量的亚硝酸盐对耦合反应产生影响，使耦合的组分发生氧化、硝化反应，继而出现褪色现象，导致其影响结果的准确性。为此，使用本方法后，因其具有线性范围广的特性，则可完全避免褪色现象发生，进一步提高实验结果的准确性。

图1 环己醇亚硝酸酯色谱图Fig.1 Gas chromatogram of cyclohexanol nitrite

图2 亚硝酸盐含量标准曲线Fig.2 The standard curve of nitrite

2.2 加标回收试验和精密度试验

以咸菜为例，称取同一均匀绞碎不含本底的咸菜样品共18份，分成3组，每组分别加入160 μg、420 μg、800 μg亚硝酸盐标准溶液，按本文所述方式进行检测，连续开展6次实验，取得结果见表1。

表1 加标回收率和精密度试验结果(n=6)

2.3 衍生条件优化试验

通过加入10% 环己基氨基磺酸钠10 μL、50 μL、100 μL、250 μL、500 μL、1000 μL、2000 μL用本试验方法进行检测，结果显示在500 μL以上时，其信号响应不再随环己基氨基磺酸钠的含量增加而升高，因此本试验选择加入500 μL的10%环己基氨基磺酸钠进行测定。

2.4 衍生温度的影响

将已知浓度的样品按本试验方法在0 ℃冰浴、25 ℃室温、60 ℃水浴、100 ℃加热的条件下进行反应后，在同一色谱条件下进行分析，其结果表明在冰浴条件下信号响应值最大，因此选择在冰浴下进行本试验。

2.5 本法与国标方法比较

用本试验方法与国标分光光度法对30个不同类别样品进行检测，其结果见表2。同时用SPSS13.0软件对衍生-气相色谱法与分光光度法检测结果作两配对样品t检验(T-Ttest)的统计分析，得到t=1.397，p=0.173，按α=0.05水准，无统计学差异，说明两种方法检测同一样品中亚硝酸盐没有统计学差异。

表2 本方法与分光光度法测定亚硝酸盐结果比较

3 结 论

通过本试验建立了衍生-气相色谱测定食品中亚硝酸的方法，相对于其它的食品中亚硝酸盐检测方法分光光度法、离子色谱法、荧光法、电化学法、化学发光法、示波极谱法等，后者都存在一定的局限性，操作步骤繁琐，干扰因素多，检测范围窄的缺点，容易造成结果的误判。而衍生-气相色谱测定食品中亚硝酸的方法，由于其具有简化前处理步骤，灵敏度高、线性范围广的特性，且准确度、精密度、回收率均能满足检测需求，并可用于食物中毒事件发生时的亚硝酸盐测定，对于临床救治，尤其是保障人民群众生命安全以及监督管理工作有着十分重要的作用。综上所述，对食品中亚硝酸盐中的检测方法多很多种，每一种方法都有其优点，也有其不足之处，对亚硝酸盐的检测要根据不同精度的要求选取不同的检验方法，不过最终的目的就是把亚硝酸盐控制在安全范围之内，保证人民的生命安全。