高文科 李明海 赵兴东 吴兴恩 彭 磊 王梓然*

(1.云南农业大学 园林园艺学院，昆明 650201;2.云南省玉溪市元江县农业技术推广中心，云南 玉溪 653300)

芒果(MangiferaindicaL.)是漆树科杧果属的一种热带亚热带常绿大乔木，是著名的热带亚热带水果[1]。芒果被誉为“热带水果之王”，因其具有颜色丰富、果形多样等较好的外观品质以及肉质细嫩、香气浓郁和营养价值高等优良的内在品质而备受国内外消费者喜欢。近年来，随着芒果栽培面积的不断扩大，产量逐年上升，已经成为世界五大水果之一[1]。芒果果实中含有多种有益于身体健康的生物活性成分，如糖分、能量和丰富的膳食纤维，同时芒果也是人体获取矿物质、维生素A、维生素C、类胡萝卜素和多酚较好的来源[2]。芒果果实色泽多样，主要有红皮黄肉型、绿皮黄肉型和黄皮黄肉型等。果实色泽是评价果实鲜食品质和商品价值的重要指标，也是影响种植者和消费者选择的最重要的因素之一[3-4]。

近几年，次生代谢物质的重要性及其对水果口感的贡献受到众多研究者的关注，但大部分代谢物功能和代谢途径还未明确，缺乏对整个代谢网络和某类代谢物系统全面的研究[5]。次生代谢物质的检测随着代谢组学技术的发展而不断完善和丰富，代谢组学也是继基因组学、蛋白质组学和转录组学之后为分析检测复杂多变生物代谢网络的技术手段。随着代谢组学的发展，一些果实次生代谢物质如花青素、类黄酮、类胡萝卜素和挥发性代谢物等代谢组检测也在众多园艺产品上得到广泛应用，包括百香果[6]、枇杷[7]、木瓜[8]和黄桃[9]等。类胡萝卜素代谢组学以类胡萝卜素的生物合成途径为基础，以异戊烯焦磷酸为前体，经过异戊二烯焦磷酸异构酶(Isoprene pyrophosphate isomerase, IPI)、牻儿苗属二磷酸酯合成酶(Geranylgeranyl diphosphate synthase，GGPS)、植物烯合成酶(Phytoene synthase, PSY)、植物烯不饱和酶(Phytoene desaturase, PDS)、胡萝卜素不饱和酶(Zeta-carotene desaturase, ZDS)和番茄红素-β-环酶(Lycopene-β-cyclase, LycB)等酶催化，产生各类类胡萝卜素，如α、β、γ和δ等类型[10]。在植物中，β-胡萝卜素作为类胡萝卜素生物合成途径中重要的合成产物，占总胡萝卜素含量的60%～70%[11]，使水果呈现出特有的黄色和橙色[12]。利用类胡萝卜代谢组学研究表明，随着柑橘果实着色类胡萝卜素代谢物质如八氢番茄红素、β-隐黄质、玉米黄质和紫黄质逐渐积累，并且在柑橘果皮中也发现了很大比例的类胡萝卜素物质[13]。在不同果肉颜色的柑橘品种中，β-蝶形黄质和β-虾青素是果肉呈现黄色的主要类胡萝卜素物质[14]。此外，有研究发现在橙色果肉的杏中主要类胡萝卜素物质为β-胡萝卜素和(E/Z)-卟啉，其次是β-蝶形黄质和叶黄素[15]。而类胡萝卜素物质积累量的差异也是导致枇杷果实颜色呈现黄色和白色的主要原因[16]。Ma等[17]利用HPLC技术在‘台农一号’芒果黄色果肉中发现主要的类胡萝卜素是β-胡萝卜素和α-胡萝卜素，其次为β-蝶形黄质和玉米黄质。类胡萝卜素作为一些与果实风味有关的化合物的前体，不但影响果实的品质，同时也是判断果品成熟与采收的重要标准之一。

果品的适时采收是果树上最常用的栽培管理措施，广泛应用于香蕉、猕猴桃、南果梨和芒果等果树。当果实达到商品成熟时期采收，在一定程度上可以改善果品过度成熟造成的易腐烂、病害增多和外观品质下降等不利因素。除了易于储藏、运输和延长果品货架期之外，商品成熟时期采收还可以显著提升果实的外观品质[18]。果实在商品成熟时期含有大量的淀粉、有机酸和单宁物质，果皮中含有较多的叶绿素，当果实进入生理成熟时期，果实中次生代谢物质发生了大量变化，通过分析碳水化合物、有机酸、果胶、单宁及色素成分的改变可以判断果实的品质高低[19]。芒果是典型的“后熟”水果，在芒果贮藏和成熟的过程中，次生代谢物质可以从与糖苷结合的化合物中释放出来[20]。之前对于芒果的研究主要集中于果皮色泽含量以及果实可溶性固形物、总糖和总酸等基本代谢产物的鉴定，缺乏关于从商品成熟到生理成熟时期果实内部次生代谢物质系统变化规律以及果实中类胡萝卜素等次生代谢物质的靶向代谢组学的研究。

本研究以‘金凤凰’芒果为试材,为更好地了解芒果果实“后熟”过程中果实色泽和内在品质相关次生代谢物质的变化，本研究利用广泛靶向代谢组学和靶向类胡萝卜素代谢组学对商品成熟和生理成熟期芒果果实进行了分析，通过代谢组学鉴定了芒果商品成熟和生理成熟期品质相关次级代谢产物包括碳水化合物、有机酸、氨基酸和类胡萝卜素等次生代谢产物的变化，旨在为深入研究芒果果实着色和品质形成的代谢调控机制提供理论依据，为优质芒果果品的生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 植物材料和收集方法

早中熟芒果(MangiferaindicaL.)品种‘金凤凰’种植于云南省玉溪市元江哈尼族彝族傣族自治县(101°39′～102°22′ N, 23°18′～23°55′ W)，树龄10年，露地栽培，株行距为3 m×5 m。在芒果花后100 d左右进行样品采收，记为商品成熟期(Commodity maturity， CM)；在室温条件下，商品成熟期芒果果实贮藏后熟达到生理成熟，记为生理成熟期(Physiological maturity， PM)。从果园选取5株生长状态相近的树随机采集芒果果实，每30个果实为1个样本，每个样本设3个生物重复。将收集的芒果果实用刀片切分为0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小、约15 g重的果粒，放入液氮速冻后置于-80 ℃的超低温冰箱保存，为进一步的广靶代谢组和类胡萝卜素代谢组检测提供样品。

1.2 样品制备和代谢物提取

将芒果果实样品在液氮冷冻后粉碎研磨均匀，用带锆珠的冷冻混合球磨机(MM 400，Retsch，德国)在30 Hz下粉碎1.5 min。称取冷冻干燥粉末状的样品(100 mg)，在4 ℃下用1.2 mL 70%的甲醇水溶液提取过夜，12 000 r/min离心10 min，吸收提取物(CNWBOND碳-GCB SPE盒，250 mg，3 mL；ANPEL，中国上海)并过滤(SCAA-104，0.22 μm孔径；ANPEL)。芒果果实样品提取物采用LC-ESI-MS/MS系统进行分析。分析条件如下：HPLC柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18(1.8 μm，2.1 mm 100 mm)；溶剂体系为A相超纯水(0.1%甲酸)和B相乙腈(0.1%甲酸)；洗脱梯度程序：0 min时V(A)∶V(B)=95∶5，11.0 min时V(A)∶V(B)=5∶95，12.0 min时V(A)∶V(B)=5∶95，12.1 min时V(A)∶V(B)=95∶5，15.0 min时V(A)∶V(B)=95∶5；流速：0.35 mL/min；温度：40 ℃；进样量：4 μL。出液交替连接到ESI-三重四极线离子阱(Q-TRAP)-MS采集分子粒子碎片离子质谱数据[21]。

1.3 代谢物的鉴定与量化

LIT和三重四极杆(QQQ)扫描在QQQ-线型离子阱质谱仪(Q TRAP)、API 6500 Q TRAP LC/MS/MS 系统上采集，该系统配备ESI Turbo I-Spray 接口，以正离子模式工作，由Analyst 1.6.3软件(AB Sciex)控制。ESI源操作参数如下：离子源，turbo喷雾；源温，550 ℃；离子喷雾电压(IS)5 500 V；离子源气体I(GSI)、气体II(GSII)、幕气(CUR)分别设置为55、60和25 psi；碰撞气体(CAD)为高。在QQQ和LIT模式下分别用10和100 μmol/L聚丙烯乙二醇溶液进行仪器调谐和质量校准。QQQ扫描作为MRM实验采集，碰撞气体(氮气)设置为5 psi。Declustering电位(DP)和碰撞能量(CE)的单个MRM过渡与进一步DP和CE优化。根据每个时期内洗脱的代谢物，监测1组特定的MRM转换。代谢物数据分析采用Analyst 1.6.1软件(AB SCIEX，加拿大)进行，代谢物的定量采用MRM进行，对确定的代谢物进行部分最小二乘判别分析(PLS-DA)，含量差异显著的代谢物设定阈值为投影中可变重要性(VIP)≥1，Log2FC≥2或≤0.5[21]。

1.4 类胡萝卜素代谢物的检测

将冷冻芒果果实样品在液氮中粉碎研磨均匀并用带锆珠的冷冻混合球磨机(MM 400，Retsch，德国)在30 Hz下粉碎1.0 min；称取粉末状的样品(50 mg)，加入内标，并用含0.01% BHT的混合溶液(V(正己烷)∶V(丙酮)∶V(乙醇)=1∶1∶2)提取。将提取液在室温下涡流20 min，重复提取1次后离心合并上清液。将得到的提取液浓缩之后用V(甲醇)∶V(甲基叔丁基醚)=3∶1的混合溶液复溶，溶液经0.22 μm过滤器过滤后，进一步进行LC-MS 分析。样品提取液采用LC-APCI-MS/MS系统进行分析。分析条件如下：HPLC：色谱柱，YMC C30(3 μm，100 mm×2.0 mm i.d.)；溶剂体系：V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶3，加0.01% BHT和0.1%甲酸(A)，甲基叔丁基醚加0.01% BHT(B)；梯度程序，从0% B(0～3 min)开始，增加到70% B(3～5 min)，然后增加到95% B(5～9 min)，最后回升到0% B(11～12 min)；流速：0.8 mL/min；温度：28 ℃；进样量：2 μL。API 6500+Q TRAP LC/MS/MS 系统，配备APCI Turbo Ion-Spray接口，工作模式为正离子，由Analyst 1.6.3软件(AB Sciex)控制。APCI源操作参数如下：离子源，APCI+；源温350 ℃；帘气(CUR)设置在25 psi。对单个MRM过渡的DP和CE进行了进一步的DP和CE优化。根据每个时期洗脱的类胡萝卜素，对每个时期的一组特定的MRM过渡进行监测[21]。

2 结果与分析

2.1 芒果成熟阶段的代谢差异及风味物质的积累

代谢组试验材料芒果商品成熟期果实样品(CM)和生理成熟期果实样品(PM)见图1(a)。对2个芒果果实样品代谢产物的气相色谱-质谱数据进行了主成分分析(1(b))，结果表明2个样品在3次生物学重复中的代谢物组成明显分离，第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)在CM和PM样本之间明显分离，主成分分析很容易区分CM和PM，PC1和PC2分别占了总方差的58.45%和18.37%。代谢组分析结果表明在CM 和 PM中共发现有309种差异代谢产物，其中上调95个，下调214个(图1(c))。总体而言，商品成熟的芒果果实相比生理成熟的果实，大多数代谢产物呈下调表达趋势。随着芒果果实“后熟”一系列碳水化合物成分的逐渐变化，最终导致果实甜度和酸度等内在品质性状的改变。不同代谢物的含量和类型可能在确定芒果口感中起着至关重要的作用。商品成熟期的果实虽然获得优良的储运性和商品性，但果肉的次生代谢物质，如糖、有机酸和酯的积累方面表现出差异，生理成熟期果肉中次级代谢产物呈增加趋势(图1(d))，除了糖类和类胡萝卜素物质大量积累，还包括有机酸、酯类、萜类和醇类物质。

(a) 商品成熟和生理成熟期芒果果实外观图；(b) PCA分析；(c) 差异显著代谢物火山图；(d) 代谢产物热图。(a) Appearance of mango fruits at commercial maturity (CM) and physiological maturity (PM); (b) PCA analysis; (c) Volcano plot of diffrentially significant metabolites; (d) Heat map of metabolites.图1 芒果果实材料与代谢组差异分析Fig.1 Mango fruit material and difference analysis with metabolome

2.2 差异代谢物的KEGG分类和富集分析

利用KEGG数据库对差异代谢物进行注释，将这309种代谢物映射到KEGG数据库中，结果显示主要富集为20个代谢途径(图2)。随后，以P值<0.05进行KEGG路径差异富集分析，筛选出7个不同的显著差异代谢途径，主要有：代谢途径、柠檬酸盐循环(TCA循环)、次生代谢物的生物合成、光合作用生物体的碳固定、乙醛酸和二羧酸代谢、2-氧代羧酸代谢和氨基酸的生物合成。KEGG结果表明，大部分的代谢物富集到“代谢途径(Metabolic pathways)”，符合预期。因为果实在生理成熟时果实次级代谢产物大量合成，糖酸含量和类胡萝卜素含量不断升高使得果实呈现出更佳的口感。此外，部分代谢物被归入“氨基酸的生物合成(Biosynthesis of amino acids)”，这表明芒果果实可能具有潜在有益健康的效果。KEGG富集分析确定了这2个不同时期果实代谢物的差异变化，也为更深入研究果实内在品质形成的分子代谢机理奠定了基础。

图2 芒果果实代谢组数据的KEGG分类与富集分析Fig.2 KEGG classification and enrichment analysis for mango fruits metabolome

2.3 氨基酸和有机酸代谢

内在品质和营养物质的呈现主要为有机酸、氨基酸和糖类等。将VIP(Variable importance in projection)≥1、|log2FC|≥5作为显著差异的阈值，从PM 和CM样品中共鉴定出22种明显差异表达的内在品质相关代谢物，包括6种氨基酸及其衍生物，10种有机酸及其衍生物以及4种糖类和2种维生素(表1)。在CM和PM中筛选出的6种氨基酸和衍生物中有2种为上调表达，4种为下调表达。在显着下调的代谢产物中己酰-L-甘氨酸、O-磷酸-L-丝氨酸、γ-L-谷氨酸-L-半胱氨酸和谷胱甘肽还原型均达到10倍显著差异水平。共有10种差异代谢物被鉴定为有机酸，其中2-羟基-2-甲基丁酸、羟基丙二酸半醛、4,5,6-三羟基-2-氧己酸、磷酸烯醇式丙酮酸、6-羟基己酸、丙二酸和DL-甘油醛-3-磷酸分别下调10.13、11.58、12.67、14.58、14.73、15.32和15.92倍。筛选出的糖及醇类物质有4种，其中1个上调表达，3个下调表达。以上代谢产物的显著差异水平，解释了生理成熟期芒果比商品成熟期芒果的口感和风味更加丰富的原因。

表1 “金凤凰”芒果商品成熟和生理成熟期果肉显著差异的次生代谢物质Table 1 Differentially accumulated flavor compounds (VIP≥1 and |Log2FC|≥5) between commoditymaturity and physiological maturity stages in the cv.‘Jin fenghuang’mango

2.4 类胡萝卜素代谢组分析

类胡萝卜素在植物光合作用和脂质过氧化过程中起着重要作用，并影响植物果实的颜色性状。为了更加清楚的了解芒果果肉着色代谢机理，本试验分析了芒果CM和PM的果肉类胡萝卜素合成代谢途径中代谢产物表达水平的动态变化，在类胡萝卜素生物合成途径中发现了4个显著差异代谢物，其中α-胡萝卜素和β-胡萝卜素含量在CM中分别显著降低3.40和3.31倍，依据前期转录组研究发现β-胡萝卜素合成相关的结构基因，如ZDS、LYCB和LCYC等结构基因表达量均在PM期迅速升高，这可能导致了类胡萝卜素生物合成途径中相关代谢产物的差异表达(图3(a))。其次，商品成熟期的芒果果肉呈现淡黄色，而在生理成熟的过程中呈现橘黄色，α-胡萝卜素和 β-胡萝卜素含量的差异是导致果肉呈现不同颜色的原因。类胡萝卜素代谢组聚类热图分析结果表明，在CM 和PM鉴定到的36个类胡萝卜素物质中共有15个代谢产物达到显著差异水平，其中1个代谢物呈增加趋势，14个代谢物呈现降低趋势(图3(b))。这一结果可为其他果实呈色机理研究提供新思路，为探索芒果果实中β-胡萝卜素含量的调控措施和培育富含β-胡萝卜素的芒果新品种奠定基础。

(a)类胡萝卜素生物合成代谢途径；(b)差异代谢产物热图。(a) Carotenoid biosynthesis metabolic pathway; (b) Heat map of differential metabolites.图3 商品成熟和生理成熟芒果果实类胡萝卜生物合成途径差异代谢产物Fig.3 Differential metabolites of carotenoid biosynthetic pathways in commodity maturities and physiological maturity mango

3 讨论与结论

3.1 糖和有机酸次生代谢网络变化丰富了芒果果实内在品质的构成

利用LC-MS/MS数据进行广泛靶向代谢组分析，已成功地用于大规模代谢物分析和一些重要植物的比较代谢组学[13-21]。以往研究芒果代谢物的重点是特定类别的代谢物，如果实糖类(果糖、葡萄糖和蔗糖)、有机酸和氨基酸以及叶和花中的酚类物质[22]，然而关于芒果栽培品种在商品成熟期和生理成熟期的次生代谢特性还缺乏系统研究。本研究利用基于LC-MS/MS的广泛靶向代谢组学和类胡萝卜素代谢组学了解了‘金凤凰’芒果2个时期的内在品质代谢产物变化；通过代谢组，共鉴定了603种代谢物，其中309种代谢物以差异表达的方式积累在生理成熟之后的果肉组织中；分析确定了芒果果肉中的大量碳水化合物，包括20种糖类，其中有14种糖类在商品成熟期的果肉中浓度显著较低，例如D-Glucoronic acid、D-Fructose-1,6-biphosphate、D-Ribose、Mannitol和Dulcitol这5类，可能是构成芒果果实风味滋味物质的主要糖类；而差异表达的有机酸共鉴定到50种，其中有34种物质在商品成熟期的果实中浓度明显低于生理成熟果实，这可以在一定程度上揭示果实在商品成熟期风味不足的原因。芒果商品成熟期果实经过室温贮藏“后熟”之后，果实内糖酸等次级代谢产物不断积累，氨基酸物质的含量逐渐提高，对生理成熟期果实内在品质的提升起到了关键作用[23]。

3.2 类黄酮次生代谢物质的增加可提高芒果果实抗病性

通过商品成熟和生理成熟期芒果代谢组的分析，发现了在苯丙烷生物合成途径中的代谢产物如酚类物质、木质素、类黄酮和黄酮醇等代谢物的变化和积累。类黄酮物质是植物体内重要的抗菌物质，具有抗氧化活性，也可抵御入侵病原物，提升果实抗病性[24]。研究表明，在CM和PM中，异黄酮(芒柄花素-7-O-(6″-丙二酰)葡萄糖苷 Formononetin-7-O-(6″-Malonyl)glucoside)、黄酮醇(山奈酚-7-O-葡萄糖醛酸苷 Kaempferol-7-O-glucuronide)、木质素(落叶松脂素-4′-O-葡萄糖苷 Lariciresinol-4′-O-glucoside)以及香豆素(秦皮素 Fraxetin)等次生代谢产物分别增加3.12、8.56、12.74和14.41倍，同时随着芒果果实生理成熟，13种黄酮、木质素和香豆素代谢产物显著增加，研究表明这些异黄酮类和黄酮类物质可以增强对病原体的防御[25]。此外，苯丙烷途径的产物可以与有益微生物相互作用共同抵御病原菌的侵害从而提升果实的抗病性[26]。

3.3 芒果果实类胡萝卜素合成调控

由类胡萝卜素、叶绿素和类黄酮构成的果皮颜色是果实品质优劣的另一个决定性因素。代谢组研究发现，果皮中类胡萝卜素和类黄酮的含量明显不同[27]。已知的类胡萝卜素有600多种，是植物的许多器官，如花、果实、根和叶的主要色素，对植物的观赏和经济价值起着重要作用[28]。在‘金凤凰’芒果成熟过程中，果皮叶绿素几乎完全丧失，而类胡萝卜素的含量则有所增加。研究表明，β-胡萝卜素的生物合成结构基因的表达受多种转录因子(TFs)调控，根据TFs所含保守结构域的不同，大致分为 MYB(V-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)、bHLH(Basic helix-loop-helix)、MADS box、NAC和bZIP(Basic leucine zipper)几个家族[29]。其中，柑橘CrMYB68可以直接负向调节CrBCH2和CrNCED5从而导致类胡萝卜素的积累；番茄SlMYB72直接与PSY、ZDS和LycB酶基因结合，调节类胡萝卜素的生物合成[30]；CpbHLH1和CpbHLH2单独调控木瓜果实成熟过程中番茄红素β-环化酶基因(CpCYC-B和CpLCY-B)的转录[31]。芒果的后熟阶段对类胡萝卜素的生物合成很重要，虽然本研究中揭示了类胡萝卜素合成代谢差异，但未从分子生物学角度进行深入解析，对于类胡萝卜素的合成调控机理也尚待解决。因此，在未来的研究中将对参与类胡萝卜素生物合成调控基因的表达水平进行分析，特别是与β-胡萝卜素合成有关的结构基因以及MYB、bHLH和NAC等转录因子进行进一步研究。

本研究利用广泛靶向代谢组学和类胡萝卜素代谢组学，共检测到了309种差异代谢产物和68种类胡萝卜素代谢物质，全面解析了商品成熟期和生理成熟期芒果果实色泽品质和内在品质形成的代谢机理，为深入研究芒果果实着色和内在品质形成的代谢调控机制提供理论依据, 进一步为优质芒果果品的生产提供参考。