韩杰　王璐瑶　冯瑞章　梁启明　梁寒峭　魏琴　张勇波

摘要：【目的】明确柠檬酵素对小鼠降脂减肥作用及免疫功能的影响，为探究柠檬酵素用于治疗肥胖引起的高血压、糖尿病和心血管疾病提供理论依据。【方法】以SPF级雄性C57BL/6J小鼠为研究对象，通过饲喂H10301型60%高脂高糖饲料35 d构建肥胖模型，然后以低剂量（310.0 mg/kg）、中剂量（620.0 mg/kg）、高剂量（1240.0 mg/kg）檸檬酵素及奥利司他（阳性对照，15.6 mg/kg）分别经口灌胃肥胖小鼠，持续给药42 d，空白对照组小鼠饲喂普通饲料及灌胃等体积的生理盐水。给药期间记录动物体重及摄食量;给药结束后计算小鼠的Lee’s指数、脏器指数及脂体比，测定各处理组小鼠的血脂水平[总甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）]及葡萄糖耐量，制作组织切片观察肝脏脂质沉积情况和病理变化，并通过流式细胞术检测小鼠脾脏淋巴细胞各亚群比例。【结果】经柠檬酵素处理后可有效降低肥胖小鼠的体重、Lee’s指数和脂体比，其中以柠檬酵素高剂量组的效果最佳，表现为小鼠的体重和Lee’s指数极显著低于肥胖模型组小鼠（P<0.01，下同），脂体比显著低于肥胖模型组小鼠（P<0.05，下同），但对小鼠的摄食量无显著影响（P>0.05，下同）。灌胃柠檬酵素后，肥胖小鼠的肝脏指数明显下降，而脾脏、心脏和肾脏的脏器指数均无显著差异;血清中的TC、TG和LDL-C水平较肥胖模型组小鼠呈不同程度的下降趋势，HDL-C水平则极显著升高;柠檬酵素可改善肥胖小鼠肝脏中脂质聚积的情况，其葡萄糖耐受能力也得到明显改善。此外，柠檬酵素能促进肥胖小鼠脾脏中CD4比例升高，同时降低CD8比例，且具有一定的浓度依赖性，在高剂量柠檬酵素作用下CD4/CD8比值由肥胖模型组小鼠的1.49±0.11上升至3.20±0.42;CD4Foxp3在柠檬酵素介入后显著降低。【结论】柠檬酵素对高脂饲料诱导肥胖小鼠具有较强的减肥效果，还能改善肥胖小鼠免疫状态较差的现象，因此柠檬酵素可作为减肥保健食品在慢性疾病辅助治疗中推广应用。

关键词： 小鼠;柠檬酵素;肥胖症;脂质沉积;葡萄糖耐量;淋巴细胞亚群

中图分类号： S816.75                            文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2022）02-0557-11

Beneficial effects of lemon enzyme on high-fat diet-induced obesity and immune function in mice

HAN Jie WANG Lu-yao FENG Rui-zhang LIANG Qi-ming LIANG Han-qiao WEI Qin ZHANG Yong-bo

（1College of Life Sciences & Food Engineering， Yibin University/Key Lab of Aromatic Plant Resources Exploitation and Utilization in Sichuan Higher Education， Yibin， Sichuan  644000， China; 2Dean of Biomedical School， Beijing City University， Beijing  100094， China; 3Yibin Longmao Lemon Plantation Company， Yibin， Sichuan  644000， China）

Abstract：【Objective】To illustrate the effect of lemon enzyme on reducing fat， weight loss and immune function in mice， so as to provide a theoretical basis for the treatment of hypertension， diabetes and cardiovascular diseases caused by obesity by lemon enzyme. 【Method】 C57BL/6J mice of SPF grade were fed H10301， a 60% high-fat and high sugar diet for 35 days to establish the obesity model. Then， the mice of the fat model group were gavaged with either a low concentration （310.0 mg/kg）， medium concentration （620.0 mg/kg） or high concentration（1240.0 mg/kg） of citrin for 42 days. Orlistat （15.6 mg/kg） was used as a positive control. The mice of the control group were fed with normal diet and normal saline of the same volume. The body weight and food intake were recorded during administration. After administration， the Lee’s index， organ index and lipid body ratio were calculatedand the blood lipid levels [total triglyceride （TG）， total cholesterol （TC）， high density lipoprotein cholesterol （HDL-C）， low density lipoprotein cholesterol （LDL-C） and glucose tolerance of mice in each treatment group were measured. Tissue sections were prepared to observe the changes in liver lipid deposition and pathological structure and the proportion of lymphocyte subsets in the mouse spleen were detected by flow cytometry.【Result】Fat model groups receiving a lemon enzyme treatmenthad significantly lowered body weight， Lee’s index and fat body ratio， of which the treatment with the high concentration of lemon enzyme produced the best improvements：relative to the control group， the body weight and Lee’s index of mice were notably and significantly lower （P<0.01， the same below） and the fat body ratio was significantly lower （P<0.05， the same below）， with no significant effect on mice food intake （P>0.05， the same below）. After intragastric administration of lemon enzyme， the liver index of obese mice decreased significantly， but there was no significant difference in the organ indices of spleen， heart orkidney. The levels of serum TC， TG and LDL-C were decreased in varying degrees compared with the control group， while the level of serum HDL-C increased significantly. Lemon enzyme reduced lipid accumulation in the liver of obese mice， with an improved glucose tolerance. In addition， lemon enzyme increased the proportion of CD4 in the spleen of obese mice and reduced the proportion of CD8. After treatment with the high concentration lemon enzyme， the ratio of CD4/CD8 changed from 1.49±0.11 to 3.20±0.42 in the obese model group. CD4Foxp3 decreased significantly after lemon enzyme intervention. 【Conclusion】 Lemon enzyme can reduce weight induced by a high-fat diet and improve the poor immune state in obese mice. Therefore， lemon enzyme can be used as a weight loss health food in the adjuvant treatment of chronic diseases.

Key words： mice; lemon enzyme; obesity; lipid accumulation; glucose tolerance; lymphocyte subsets

Foundation items： National Natural Science Foundation（31700025）; Open Fund Project For Development and Utilization of Spice Plant Resources of Sichuan Provincial Key Laboratory（2018XLZ011）

0 引言

【研究意义】肥胖症是由遗传、运动、饮食和环境等多种因素共同作用而形成。随着社会经济的发展和人类生活水平的不断提高，饮食结构与生活方式也随之改变，超重和肥胖的问题逐渐突出（Formiguera and Cantón，2004）。目前普遍认为，引起肥胖症的最基本原因是体内能量代谢平衡失调而引起脂肪堆积（邹大进和吴鸿，2006;黄桂丽等，2021）。此外，肥胖可导致机体白细胞分布和数量的改变，造成淋巴细胞活性下降及免疫系统防御功能降低（刘砺等，2017），进而给人类健康造成影响。因此，开展以天然健康产品为原料的减肥产品对改善肥胖症及提高自身免疫具有重要意义。【前人研究进展】食用植物酵素是以植物为原料，经微生物发酵制得含有特定生物活性成分的可食用新型发酵健康食品。由于酵素中富含纤维素酶、酚类、有机酸类和超氧化物歧化酶等一系列生物活性物质，具有抗菌消炎、分解消化及润肠通便等功效，已成为近年来功能保健食品研究领域的热点之一（刘加友和王振斌，2016）。戴凌燕等（2010）研究发现，糙米酵素有助于降低血脂，提高体内消化酶含量，从而起到减肥作用。郭爽（2015）研究表明，敖东酵素可有效抑制大鼠体重增长和脂肪的积累，具有减肥功效。马巧灵等（2015）以自制的苹果酵素灌胃II型糖尿病小鼠28 d，结果表明苹果酵素能有效抑制II型糖尿病小鼠血糖的增加，且降低血清中血脂（Triglyceride，TG）和总胆固醇（Total cholesterol，TC）的含量，但有关酵素降糖降脂的作用机理尚不明确。Garcia-Diaz等（2015）、邵颖等（2018）通过构建大鼠肥胖模型，以大鼠的体重增加量、体脂质量及脂肪/体重比为考察指标，评价酵素对肥胖大鼠的减肥功效，结果发现植物酵素可明显改善肥胖大鼠的各项指标，具有一定的减肥功效。于苗等（2019）研究发现，中剂量长白山果蔬发酵物不仅能降低肥胖大鼠的体重，还具有降低TG和TC及升高高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的功效，推测与发酵物富含水溶性膳食纤维能起到降血脂的作用且增加大鼠的饱腹感有关。此外，酵素在农业和畜牧业领域同样应用广泛，主要集中在农作物增产、改善农产品质量、防治病虫害和修复土壤等方面（文亚雄和谭石勇，2016），将酵素与饲料相结合可提高饲养效率和降低成本，且能降低禽畜发病率（张昕悦等，2018）。赵英和金琳（2015）通过研究新型玉米酵素专用肥对玉米生长发育的影响，发现施用酵素肥的玉米根系发达、毛细根系数量增加，玉米植株生长发育良好，其产量显著提高。文亚雄和谭石勇（2016）研究证实，使用酵素菌肥料能有效改良土壤结构，保持土壤水分及温度，促进土壤养分的转化和植物对养分的吸收，且能提高土壤中的有机质含量。万赛罗等（2019）研究表明，在白山羊精料中添加酵素营养液能有效增加其增长速率，加快育肥进程，同时能增加白山羊的体重，提高养殖经济效益。柠檬[Citrus limon （L.） Burm. F.]属于芸香科（Rutaceae）柑橘属常绿小乔木，是继橙、柑之后第三大柑橘品种。柠檬中富含类黄酮、维生素、膳食纤维、香精油、类胡萝卜素和生物碱等成分，在预防糖尿病、心血管疾病和癌症等方面具有重要的生理功能（张思等，2016;周淑仪等，2018）。柠檬酸可有效预防代谢类疾病，降低肥胖的风险（González-Molina et al.，2010）。此外，柠檬汁可降低高尿酸小鼠中的血清尿酸水平，即食用柠檬可能对高尿酸血症有改善作用（Wang et al.，2017）。【本研究切入点】目前，针对柠檬酵素的研究主要集中在其抗氧化能力等方面（张超等，2017;阳刚等，2018），有关柠檬酵素降血脂的研究至今尚无相关报道。【拟解决的关键问题】通过研究柠檬酵素对小鼠降脂减肥作用及淋巴细胞数量和功能的影响，了解柠檬酵素对肥胖及肥胖导致免疫功能失调的调控作用，为探究柠檬酵素用于治疗肥胖引起的高血压、糖尿病和心血管疾病提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

SPF级雄性C57BL/6J小鼠[许可证号SCXK（京）2020-0004]购自北京华阜康生物科技股份有限公司，规格13～15 g。H10301型60%高脂高糖饲料（含蛋白质20%、碳水化合物20%、脂肪60%、热量5.24 kcal/g）和對照饲料（含蛋白质20%、碳水化合物70%、脂肪10%、热量3.85 kcal/g）购自北京华阜康生物科技股份有限公司。柠檬酵素（采用乳酸菌和酵母混合发酵6个月，批号201901130）购自四川宜宾市龙茂柠檬种植有限公司;CD3、CD4和CD8荧光抗体购自美国Biolegend公司;FoxP3荧光标记抗体、固定剂和破膜剂购自美国Ebioscience公司;裂红液购自美国Thermo公司;油红染料购自上海源叶生物科技有限公司;胆固醇检测试剂盒、甘油三酯测定试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）测试盒及高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）测试盒购自南京建成生物工程研究所。主要仪器设备：血糖测定仪（德国Merck公司），酶标仪（美国Thermo公司），FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）。

1. 2 动物建模、分组及给药

所有小鼠自由采食和饮水，饲养于SPF级动物实验室。适应性喂养7 d后，对照组小鼠继续饲喂普通饲料，其他小鼠则饲喂高脂饲料35 d;根据公式（1）计算小鼠肥胖度，取肥胖度大于20%的小鼠进行随机分组，即肥胖模型组，每组10只小鼠。给药组分别灌胃相应剂量柠檬酸酵素，空白对照组和肥胖模型组灌胃等体积的生理盐水，每天各处理组定时按照10 mL/kg的剂量进行灌胃。给药过程持续42 d，每隔4 d检测1次动物体重（g）变化及摄食量。

肥胖度（%）=（肥胖模型组小鼠体重-对照组小鼠体重）/对照组小鼠体重×100 （1）

1. 3 肥胖小鼠试验指标检测

1. 3. 1 小鼠体质量和摄食量测定 小鼠自由采食和饮水，给药期间每天上午9：00记录小鼠摄食量（g），间隔4 d称量1次小鼠体重（g）。

摄食量=给食量-剩食量    （2）

1. 3. 2 脏器指数和脂肪系数考察 最后1次灌胃给药结束后，各处理组小鼠禁食过夜，称量小鼠体重（g），游标卡尺测量体长（鼻尖到肛门外沿的距离，cm），按照公式（3）计算Lee’s指数;小鼠进行口服糖耐量测试后，摘眼球采血，按操作标准处死小鼠进行解剖，摘取肝脏、心脏、脾脏、肾脏及肺脏，用滤纸吸去脏器表面组织液，称各脏器湿重（mg），按公式（4）计算脏器指数;取睾丸和双肾周围脂肪，称量其湿重（mg），按公式（5）计算脂体比。

1. 3. 3 血清指标检测 小鼠摘眼球采血，37 ℃水浴30 min，3000 r/min离心15 min，获得血清用于血清指标检测。使用全自动生物分析仪检测血清中的TG、TC、HDL-C和LDL-C的含量。

1. 4 肝脏组织切片

1. 4. 1 肝脏组织切片及H-E染色 处死小鼠后，取肝脏组织在10%多聚甲醛中浸泡固定，对固定1周后的组织进行修块、流水浸泡过夜，常规梯度酒精脱水，石蜡包埋，制作5 μm的石蜡切片。将石蜡切片放入二甲苯中进行脱蜡，放入梯度乙醇中复水后进行H-E染色，再次梯度乙醇脱水，脱水后将组织切片中的乙醇用二甲苯置换出来。滴加中性树脂，盖玻片封片，光学显微镜下观察肝脏组织的病理变化。

1. 4. 2 油红染料切片 油红O染色切片（8 μm）室温下放置10 min后用于染色。油红O贮备液与稀释液按5∶2进行混合，定性滤纸过滤后即配成应用液。应用液染色13 min 后以37 ℃蒸馏水冲洗约30 s，随后滴加复染液染色3 min，用流水冲洗1 min。滴加甘油明胶封片（在封片前应先将水性封固剂于60 ℃温水中加热至液状），光学显微镜下观察组织脂滴的分布情况。

1. 5 葡萄糖耐量试验

试验前小鼠禁食过夜，按2 g/kg的剂量腹腔注射50%葡萄糖生理盐水，分别于注射后30、60和90 min使用血糖测定仪测定小鼠外周血中的血糖含量（Glucose，mmol/L），并根据公式（6）计算糖耐量试验曲线下面积（Area under the curve，AUC），其中G（t）表示t时间点的血糖含量。

1. 6 脾脏淋巴细胞亚群检测

取小鼠新鲜脾脏组织置于不锈钢网上，加入适量PBS（pH 7.4），注射器柱柄研磨，制备脾脏单细胞悬液。1500 r/min离心5 min，弃上清液，加入2 mL红细胞裂解液重悬细胞，4 ℃孵育15 min。离心弃上清液，加入1 mL PBS重悬细胞。每个样本取100 μL单细胞悬液加入至上样管中，按试剂说明加入荧光标记抗体CD45、CD3、CD4和CD8，混匀，室温避光孵育20 min。PBS洗涤1次，加入固定剂，4 ℃孵育过夜。加入破膜剂，室温孵育60 min，加入Foxp3单抗，室温避光孵育30 min，PBS洗涤2次后以200 μL PBS重懸细胞，流式上机检测脾脏淋巴细胞亚群含量。

1. 7 统计分析

采用Flowjo V.0.7分析流式细胞数据，然后以Graphpad Prism 8.0进行统计处理，其中，多组数据进行方差分析（ANOVA），两两比较则采用独立样本 t 检验。

2 结果与分析

2. 1 小鼠肥胖模型建立

采用高脂饮食诱导小鼠肥胖模型，饲喂35 d后模型组小鼠体重与空白对照组小鼠间存在显著差异（P<0.05，下同），表明小鼠肥胖模型建立成功，小鼠随机分组后每日进行灌胃给药。在整个给药周期内，不同柠檬酵素剂量组小鼠体重虽逐渐增加，但上升趋势明显低于肥胖模型组小鼠（图1）。至灌胃给药结束时，柠檬酵素中剂量组小鼠体重显著低于肥胖模型组小鼠，柠檬酵素高剂量组小鼠体重则极显著低于肥胖模型组小鼠（P<0.01，下同），表明柠檬酵素在一定剂量使用范围内可有效控制肥胖小鼠的体重变化。

各处理组小鼠的摄食量变化趋势如图2所示。整个给药期间，各处理组小鼠每日摄食量差异并不显著（P>0.05，下同），空白对照组小鼠的摄食量略低于肥胖模型组及各药物组小鼠，药物组小鼠的摄食量有所波动，略低于肥胖模型组小鼠，但无显著差异。小鼠摄食量未受其体重变化趋势的影响，间接表明柠檬酵素可能是通过改变小鼠食物利用率来调控肥胖小鼠体重变化。

2. 2 柠檬酵素对小鼠Lee’s指数和脂肪含量的影响

Lee’s指数是评价小鼠肥胖程度的有效指标。由图3可看出，柠檬酵素低、中、高剂量组和阳性对照组的小鼠Lee’s指数较肥胖模型组小鼠均有不同程度的下降趋势，表明柠檬酵素可有效改善小鼠的肥胖程度。取小鼠肾周围脂肪和睾丸周围脂肪，称重并计算脂体比，结果发现与肥胖模型组相比，柠檬酵素低、中、高剂量组和阳性对照组小鼠的脂肪含量明显降低，且表现为柠檬酵素浓度越高，脂体比下降程度越明显。柠檬酵素高剂量组和阳性对照组小鼠的脂体比仍高于空白对照组小鼠，推测是由于给药周期较短，未能完全逆转造模前期堆积的脂肪含量，导致小鼠的脂体比较空白对照组仍具有一定差异。

2. 3 柠檬酵素对小鼠脏器指数的影响

脏器指数可用于反映动物内部器官的健康状态。由表1可知，与空白对照组小鼠相比，肥胖模型组小鼠的肝脏指数显著增加，说明高脂饲料导致小鼠出现肝脏脂肪堆积、增生和肥大等问题（黄玉军等，2020）。但灌胃柠檬酵素后，小鼠的肝脏指数明显下降，其中柠檬酵素高剂量组与肥胖模型组相比存在极显著差异;除肝脏外，脾脏、心脏和肾脏的脏器指数均无显著差异。可见，以柠檬酵素干预有利于肥胖小鼠肝脏内部脂肪代谢功能的恢复，减轻小鼠肝脏脂肪堆积情况，且未对其他器官造成明显损伤。

2. 4 柠檬酵素对小鼠血脂水平的影响

对各处理组小鼠的血脂指标（TC、TG、HDL-C和LDL-C）进行检测，结果（图4）显示，肥胖模型组小鼠的TC、TG和LDL-C水平较空白对照组小鼠呈极显著升高趋势，而HDL-C水平呈极显著下降趋势。灌胃柠檬酵素后，小鼠血清中的TC、TG和LDL-C水平较肥胖模型组小鼠呈不同程度的下降趋势，其中TC水平呈极显著降低;HDL-C水平则极显著升高，接近于空白对照组小鼠的水平，表明柠檬酵素可有效改善肥胖小鼠中的血脂异常状态。

2. 5 柠檬酵素对小鼠肝脏组织的影响

采用油红O染料对小鼠肝脏组织切片进行染色，结果（图5）显示，肥胖模型组小鼠肝脏组织中表现为红色脂滴区域较多，而柠檬酵素给药组和阳性对照组中的红色脂滴聚集区域明显减少，与空白对照组的相似，表明柠檬酵素可改善肥胖小鼠肝脏中脂滴聚积的情况。H-E染色进一步观察各处理组小鼠肝组织病理学变化，结果发现柠檬酵素介入后小鼠肝脏中的脂肪空泡区域明显减少，小鼠肝脏脂肪化现象得到明显改善，即柠檬酵素可改善肥胖小鼠的肝组织病理学变化。

2. 6 柠檬酵素对小鼠葡萄糖耐量的影响

葡萄糖耐量主要反映人体或动物自身对血糖浓度的调节能力，正常状态下机体的血糖应保持在相对稳定的范围内，具有一定的耐受能力。由图6-A可知，肥胖模型组及各给药处理组小鼠的血糖—时间曲线均在空白对照组小鼠之上;由图6-B可知，肥胖模型组小鼠的血糖AUC明显高于空白对照组及其他给药组小鼠。经不同剂量的柠檬酵素干预后，小鼠血糖AUC较肥胖模型组小鼠血糖AUC分别降低9.50%、8.71%和21.67%，其中柠檬酵素高剂量组小鼠血糖AUC极显著低于肥胖模型组小鼠。

2. 7 柠檬酵素对小鼠淋巴细胞的影响

免疫细胞主要包括淋巴细胞及各种吞噬细胞，其中淋巴细胞是发挥特异性免疫应答的主要细胞。T淋巴细胞又可分为辅助/诱导T淋巴细胞（CD4）、抑制/细胞毒T淋巴细胞（CD8）及其他细胞，如调节性T细胞（Treg，CD4Foxp3）等。其中，CD4/CD8比值能反映機体的免疫状态，是衡量机体免疫水平的重要指标。正常情况下，机体的CD4/CD8比值相对稳定，当其比值低于正常范围时表明机体处于低免疫力状态。本研究结果（表2和图7）表明，肥胖模型组小鼠的CD4/CD8比值较空白对照组小鼠明显降低，即小鼠免疫力下降，但经柠檬酵素介入治疗后能显著促进CD4比例升高，同时降低CD8比例，且具有一定的剂量依赖性，在高剂量柠檬酵素作用下CD4/CD8比值由肥胖模型组小鼠的1.49±0.11上升至3.20±0.42，表明柠檬酵素可促进免疫功能的正向调节。此外，CD4Foxp3具有免疫抑制功能，肥胖小鼠的CD4Foxp3在柠檬酵素介入后显著降低，表明其负调节功能减弱，免疫状态增强。综上所述，柠檬酵素可通过调控T细胞亚群中的CD4/CD8比值及CD4Foxp3比例，以改善肥胖小鼠机体的免疫状态。

3 讨论

奥利司他具有选择性抑制胃脂肪酶和胰脂肪酶的能力，因其在减肥方面具有积极作用，于1999年获批在欧美国家上市（Ahn et al.，2014）。但近年来的研究表明，长期服用奥利司他可能会导致一系列不良反应，如肝肾损害、胃肠不良反应及营养不良等（黄秋菊和李玉兰，2018）。因此，开发一种新型安全无害的减肥产品仍是目前研究的主要方向。酵素主要来源于果蔬和中药等，经乳酸菌、酵母菌等益生菌发酵，是一种富含益生菌、活性酶及功效成分的混合物产品（Okada et al.，2006）。柠檬是一种营养和药用价值均较高的水果，长期食用能预防心血管硬化及降血脂等（刘义武和王碧，2012），尤其是类黄酮中的橙皮苷和圣草枸橼苷具有较强的降低血脂作用（Miyake et al.，2006），一些水溶性膳食纤维也具有降血脂的功能（刘江，2020）。柠檬酵素在保留柠檬主要有效成分的基础上，增加了维生素、矿物质、多酚和黄酮等次级代谢产物，可能具备更理想的降脂减肥功效。为此，本研究通过高脂饮食建立小鼠肥胖模型，但经柠檬酵素处理后可有效降低肥胖小鼠的体重、Lee’s指数和脂体比，其中以柠檬酵素高剂量组的效果最佳，部分指标与阳性对照组（奥利司他）一致。肝脏组织的H-E染色和油红O染色结果也证实，柠檬酵素可降低脂质成分在肥胖小鼠肝脏中的堆积，改善脂肪细胞形态，防止肥胖导致的肝组织病理学变化，修复肝脏受损情况。葡萄糖耐量检测结果显示，肥胖模型组小鼠的血糖稳态受损严重，灌胃柠檬酵素和奥利司他后小鼠各时间点的血糖含量显著降低，即肥胖小鼠的葡萄糖耐受能力得到明显改善。此外，柠檬酵素并未对肥胖小鼠的摄食量造成显著影响，推测柠檬酵素主要通过调整小鼠的食物利用率控制其体重。综上所述，柠檬酵素能降低脂肪在肝脏、肾周及附睾部位的沉积，影响脂质在体内的代谢以达到减肥的目的。

在长期高脂饮食诱导肥胖过程中，通常伴随着慢性炎症的出现，最终影响机体的免疫功能（Xin et al.，2000）。肥胖对免疫功能的影响主要表现在以下几个方面：（1）影响淋巴循环和树突细胞的迁移（Weitman et al.，2013）;（2）引起T淋巴细胞表面受体种类的下调，限制T细胞识别致病性抗原类型（van der Weerd et al.，2012）;（3）促使T淋巴细胞发生免疫逃逸，使其免疫监视作用下降（Weitman et al.，2013）。脾脏是机体发挥免疫功能的重要器官，其免疫细胞比例的变化能反映免疫功能状态，除临床中常用指标CD4和CD8外，CD4Foxp3在免疫系统中的重要调节抑制作用也得到证实，成为表征免疫状态的另一主要指标（Weaver and Hatton，2009）。柠檬中的芳香类物质、类黄酮和柠檬酸等多种成分均有可能对机体免疫能力造成一定影响（Tripoli et al.，2007）。本研究在考察T细胞各亚群比例的基础上，进一步对CD4Foxp3比例进行检测，结果表明，在连续经口灌胃柠檬酵素40 d后肥胖小鼠中的CD4水平显著上调，表明肥胖导致的慢性炎症刺激已得到改善。CD4Foxp3是一类具有显著抑制作用的T细胞亚群，能通过细胞间接触、分泌抑制性细胞因子及下调APC细胞的功能，抑制其他细胞的免疫应答（Ferreira et al.，2019）。已有研究表明，高脂饮食诱导肥胖小鼠内脏脂肪组织中的CD4Foxp3比例较正常小鼠明显偏低，导致内脏脂肪组织感染炎症的概率增加及胰岛素敏感性降低等。本研究结果表明，脾脏组织CD4Foxp3比例在肥胖小鼠中的比例明显上调，究其原因可能是不同组织器官中CD4Foxp3负责功能不同所致，即CD4Foxp3通过发挥免疫抑制功能，而调节局部自身免疫和炎症反应;在外周循环中CD4Foxp3比例升高则会导致机体免疫能力下降。

4 结论

柠檬酵素对高脂饲料诱导肥胖小鼠具有较强的减肥效果，还能改善肥胖小鼠免疫状态较差的现象，因此柠檬酵素可作为减肥保健食品在慢性疾病辅助治疗中推广应用。

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（責任编辑 兰宗宝）