刘俊仙　阳太亿　刘菁　张荣华　卢曼曼　雷敬超　高轶静　丘立杭　李松　熊发前

劉俊仙（1982-），副研究员，广西知识产权中青年专家和广西标准化专家，广西大学校外硕士生导师，主要从事甘蔗生物技术与分子生物学研究工作，近期专注甘蔗全基因组转座子挖掘、开发应用及其功能研究。主持国家自然科学基金青年科学基金项目1项、地区科学基金项目1项，主持广西自然科学基金重点项目1项、面上项目2项、青年科学基金项目1项，获广西科技进步三等奖1项（排名第四），连续两次被评为广西农业科学院有功人员，以第一发明人获授权国家专利17项，以第一著作权人登记计算机软件著作权15项，主要参与育成果蔗新品种桂果蔗1号，主要参与制定广西地方标准5项，以第一作者、共同第一作者或通讯作者发表学术文章近20篇，其中SCI文章4篇。

摘要：【目的】分析Ty3-gypsy类反转录转座子反转录酶基因（RT）序列特征、多样性、系统进化关系及转录活性，为深入研究果蔗Ty3-gypsy类反转录转座子全长序列、转录转座活性及生物学功能提供理论参考。【方法】以果蔗品种拔地拉为试材，根据Ty3-gypsy类反转录转座子RT基因保守区设计简并引物对，利用其进行PCR扩增，将目的条带回收纯化后连接至pMD18-T载体，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆进行测序。依据测序结果对RT基因序列进行生物信息学分析。【结果】从果蔗拔地拉中扩增获得51条序列（SoRT4-1～SoRT4-51），去除重复序列和非RT基因序列后共获得44条RT基因序列，长度为423～433 bp，AT含量为56.84%～64.97%，AT∶GC比值为1.32～1.85，核苷酸序列间相似性为44.4%～99.3%，其编码的氨基酸序列间相似性为10.8%～100.0%，说明氨基酸序列比核苷酸序列表现出更高异质性。44条RT基因序列被划分为4个家族，其中Ⅰ和Ⅲ为主要家族。44条RT基因编码的氨基酸序列中有20条发生了无义突变，说明其突变率较高。44条RT基因编码蛋白序列存在5种保守基序，其中，有29条序列同时包含Motif 1～Motif 4，其余15条序列的保守基序变异较大，说明保守基序存在一定异质性。4个家族代表性序列编码蛋白的三级结构在氢键和转角的数量方面差异较大;系统发育进化树分析结果显示，44条RT基因序列被分为七大类，Ⅰ类和Ⅱ类中的果蔗RT基因序列分别占序列总数的40.91%和27.27%，Ⅱ类和Ⅵ类中的部分果蔗RT基因序列与拟南芥的BAB40828.1、粳稻的BAB40824.1、菠菜的BAB40833.1和大豆的BAB40834.1亲缘关系较近，推测这些物种在进化过程中发生了Ty3-gypsy类反转录转座子的横向传递。初步发现1条Ty3-gypsy类反转录转座子（SoRT4-40）具有转录活性。【结论】获得44条果蔗Ty3-gypsy类反转录转座子RT基因序列，其中仅有1条序列具有转录活性，这些RT基因序列可用于开发基于Ty3-gypsy类反转录转座子的甘蔗分子标记。

关键词： 果蔗;Ty3-gypsy类反转录转座子;反转录酶;拔地拉;多样性

中图分类号： S566.1                                 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2022）02-0287-12

Diversity analysis of Ty3-gypsy-like retrotransposonsRT gene sequences in fruit sugarcane

LIU Jun-xian YANG Tai-yi LIU Jing ZHANG Rong-hua LU Man-man LEI Jing-chao GAO Yi-jing QIU Li-hang LI Song XIONG Fa-qian

（1Sugarcane Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement （Guangxi）， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement， Nanning  530007， China; 2Cash Crops Research Institute， Guangxi Academy of

Agricultural Sciences， Nanning  530007， China）

Abstract：【Objective】To analyze the characteristics， diversity， phylogenetic evolution and transcriptional activity of Ty3-gypsy-like retrotransposons in fruit sugarcane so as to provide a theoretical reference for the in-depth study of the full-length sequence， transcriptional transposition activity and biological function of Ty3-gypsy-like retrotransposons （RTs） in sugarcane. 【Method】Using the fruit sugarcane variety Badila as the test material， degenerate primers were designed corresponding to the conserved region of Ty3-gypsy-like RT for PCR amplification. The amplified targets were recovered， purified and ligated into pMD18-T vectors. After transformation into Escherichia coli competent cells DH5α， positive clones were picked for sequencing. Ty3-gypsy-like retrotransposon sequences were analyzed by bioinformatics. 【Result】Fifty-one sequences （SoRT4-1-SoRT4-51） were amplified from fruit sugarcane Badila. After removing repetitive sequences and non-RT sequences， a total of forty-four RT sequences were obtained， with lengths of 423-433 bp，an AT content of 56.84%-64.97%，and an AT∶GC ratio of 1.32-1.85. The similarity between the nucleotide sequences was 44.4%-99.3%，whereas the similarity between the encoded amino acid sequences was 10.8%-100.0%， indicating that the amino acid sequences showed higher heterogeneity than nucleotide sequences. The forty-four RT gene sequences were divided into four families，of which I and III were the main families. Nonsense mutations occurred in twenty of the forty-four RT genes， indicating a high mutation rate. There were five conserved motifs in the forty-four RT protein sequences， of which twenty-nine sequences contained motifs 1-4 while the conserved motifs of the remaining fifteen sequences varied greatly. The protein tertiary structures of representative RT gene sequences in four families differ in the number of hydrogen bonds and corner. A phylogenetic tree analysis showed that the forty-four RT gene sequences were divided into seven classes. The sugarcane RT gene sequences in class I and II accounted for 40.91% and 27.27% of the total sequences，respectively. Some su-garcane RT gene sequences in class II and VI were closely related to those of BAB40828.1 of Arabidopsis thaliana，BAB40824.1 of Japonica rice，BAB40833.1 of spinach and BAB40834.1 of soybean. It is speculated that the lateral transmission of Ty3-gypsy-like retrotransposons occurred in the evolution of these species. One Ty3-gypsy-like retrotransposon （SoRT4-40） was initially found to have transcriptional activity. 【Conclusion】Forty-four Ty3-gypsy-like retrotransposons RT gene sequences in fruit sugarcane were obtained， of which only one sequence had transcriptional activity. Molecular markers based on these Ty3-gypsy-like retrotransposons can be used in future analyses of sugarcane genetics.

Key words： fruit sugarcane; Ty3-gypsy-like retrotransposons; reverse transcriptase; badila; diversity

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（31960416）; Guangxi Natural Science Foundation Program（2018GXNSFDA294004，2020GXNSFAA297081）;Guangxi Academy of Agricultural Sciences Fund Project （Guinongke 31960416）

0 引言

【研究意义】甘蔗是我国重要的糖料作物、能源作物和经济作物。2000年以来，甘蔗种植面积和产糖量均占我国糖料作物总种植面积和食糖总量的90%以上，甘蔗产业对于保障国家蔗糖供给安全发挥举足轻重的作用（刘俊仙等，2019）。但我国甘蔗生产品种存在单一化且长期连作，导致种性退化严重等问题，种性恢复最经济有效的办法之一就是培育甘蔗优良新品种，但传统杂交育种手段选择效率低下、选择时间长。随着生物技术的发展，分子标记辅助育种技术被广泛应用于作物的新品种选育，该技术可实现定向选择，从而提高育种效率，但限制甘蔗分子标记辅助育种进展的主要因素之一是缺乏简单、实用、高效的DNA分子标记。根据长末端重复序列（LTR）反转录转座子的高拷贝数和丰富DNA插入多态性，可开发简单实用高效的分子标记，对甘蔗分子标记辅助育种具有重要的意义。【前人研究进展】目前，ISSR（余爱丽等，2002）、RAPD（王英等，2009）、SRAP（廖诗童等，2012）、SCoT（Que et al.，2014）和AFLP（昝逢刚等，2015）分子标记技术已在甘蔗上应用，且均可检测出DNA多态性。但这些技术均存在一些弊端，如RAPD分子标记技术的重复性差;AFLP技术操作流程较繁琐，且对科研人员及实验仪器设备上要求较高;ISSR、SRAP和SCoT技术虽然操作不复杂，但结果易受扩增条件和环境的影响，导致稳定性和重复性不高。由于SSR分子标记能揭示丰富的DNA多态性，现已被广泛应用于甘蔗QTLs定位（Aljanabi et al.，2007）、遗传图谱构建（刘新龙等，2010;Andru et al.，2011）和遗传多样性分析（刘新龙等，2015）。虽然已开发出一定数量的甘蔗SSR分子标记，但数量远远不够，且扩增效率较低。近年来主要通过高通量转录组测序或简化基因组测序对甘蔗SSR标记进行规模化开发（Huang et al.，2016），但对于基因组庞大（约10 Gb）且复杂的甘蔗而言，设计出总SSR及多态性SSR标记引物还远远不够。另外，SSR分子标记在甘蔗上扩增特异性不强，扩增条带数较多，扩增条带模式复杂。LTR反转录转座子具有丰富的插入多态性、高拷贝等特性，根据这些特性已开发建立了4种主要分子标记技术，包括S-SAP、IRAP、REMAP和RBIP（Waugh et al.，1997;Kalendar et al.，1999;Flavell et al.，1998）。在其他物种上，LTR反转录转座子已被广泛研究，但在甘蔗上，鲜见相关研究报道。Rossi等（2001）以转座元件、转座酶、DNA转座子和反转录转座子为搜索关键词，搜索参数设置为期望值低于e-50，在甘蔗EST庫中进行广泛搜索，结果显示，总共获得了276个转座元件，DNA转座子和反转录转座子分别有148和128个，分别占总数的54%和46%，Ty3-gypsy类反转录转座子明显少于Ty1-copia类反转录转座子，既无LINE类和SINE类反转录转座子，也无MITE转座子。Raza等（2011）以栽培种甘蔗BL4为材料，一方面使用已知兼并引物对其进行PCR扩增，另一方面根据与Activator（Ac）和Mutator（Mu）DNA转座子同源的甘蔗表达序列标签（EST）序列设计引物对其进行PCR扩增，最终从甘蔗BL4中分离出甘蔗Ty1-copia类反转录转座子及Ac和Mu类DNA转座子;Zhang等（2016）利用多种手段从甘蔗属96个细菌人工染色体（BAC）克隆鉴定出了各类转座子。吴子莺等（2020）通过简并PCR技术从甘蔗属大茎野生种中扩增分离出60条Ty1-copia类反转录转座子反转录酶基因（RT）序列。刘俊仙等（2021）首次从甘蔗品种新台糖22中分离出36条Ty3-gypsy类逆转座子RT基因序列。【本研究切入点】目前未见对果蔗Ty3-gypsy类反转录转座子RT基因序列多样性分析的研究报道。【拟解决的关键问题】克隆果蔗品种拔地拉的Ty3-gypsy类反转录转座子RT基因序列，并分析其序列特征、多样性、系统进化关系及转录活性，不仅为研究RT基因的转录活性、转座活性及调控功能提供原始序列，还为开发果蔗基于Ty3-gypsy类反转录转座子的分子标记打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

以目前我国种植面积最大的果蔗品种拔地拉为供试材料。主要试剂：rTaq酶和载体pMD18-T购自宝生物工程（大连）有限公司;大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司;其他生化试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司。主要仪器设备：Biometra TOne PCR扩增仪（Analytik Jena AG，德国）和核酸电泳系统（Bio-Rad，美国）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 DNA提取 参考刘俊仙等（2019）的方法提取果蔗品种拔地拉的总DNA。

1. 2. 2 基因克隆 利用Kumekawa等（1999）设计的简并引物对Gyrt1和Gyrt2进行RT基因扩增。PCR的反应体系和扩增程序参考刘俊仙等（2019）进行。PCR反应体系：10×PCR Buffer 2.0 μL，50 ng/μL DNA模板1.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.5 μL，10 pmol/μL上、下游引物各1.0 μL，5 U/μL rTaq酶0.2 μL，ddH2O补充至20.0 μL。扩增程序：94 ℃，4 min;94 ℃ 30 s，45 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行35个循环，72 ℃延伸10 min。取6 μLPCR产物加入4 μL上样缓冲液并充分混合，利用1.2%琼脂糖凝胶电泳（电泳缓冲液为1×TAE）进行检测，凝胶用溴化乙锭（EB）染色后在凝胶成像系统下观察。用无菌刀片迅速切下目的条带并回收纯化，将其连接至pMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，联合使用氨苄青霉素、IPTG和X-gal进行筛选，挑取在37 ℃下培养12～16 h后的单菌落接种至LB培养基（含50 mg/L 氨苄青霉素）中培养4～6 h后进行菌液PCR鉴定，将阳性菌液送到生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序（熊发前等，2019）。

1. 2. 3 生物信息学分析 利用BLAST对扩增序列进行同源性比对，利用BioEdit对扩增序列进行统计分析，综合使用DNAMAN、Jalview和Weblogo进行序列多重比对及其Logo生成，利用Phyre2对蛋白的二、三级结构进行预测分析，综合使用RasMol和MEME计算蛋白的三级结构的转角、氢键并预测其保守基序（阳太亿等，2019）。利用MEGA 6.0的邻接法和No. of differences模型构建系统发育进化树;通过与甘蔗EST库比对鉴定Ty3-gypsy类反转录转座子的转录活性。

2 结果与分析

2. 1 果蔗RT基因克隆结果

简并PCR扩增结果（图1）显示，从果蔗拔地拉中扩增出一条约430 bp的目的条带，经过克隆、测序及序列分析，共获得51条序列（SoRT4-1～SoRT4-51）。去除重复序列和非RT基因序列后，共获得44条RT基因序列，长度为423～433 bp。对44条RT基因序列采用多重比对分析并生成Logo，如图2和图3所示。

2. 2 果蔗RT基因序列的相似性分析结果

由表1可知，44条RT基因序列的长度为423～433 bp，其中，SoRT4-1为423 bp，相较于其他序列，该序列表现为在第285～293 bp处缺失了9 bp，其次是SoRT4-20，该序列表现为在第238～242 bp处缺失了6 bp，但多数序列长度为432 bp。A和T的数量分别为109～147个和110～156个，G和C的数量分别为80～110个和55～92个，AT含量为56.84%～64.97%，AT∶GC比值为1.32～1.85（表1）。44条RT基因的核苷酸序列相似性为44.4%～99.3%，其中，SoRT4-33与SoRT4-38间的相似性最低（44.4%），SoRT4-1与SoRT4-41、SoRT4-8与SoRT4-10间的相似性均最高（99.3%）。44条RT基因编码的氨基酸序列间相似性為10.8%～100.0%。

2. 3 RT基因序列的聚类分析结果

44条RT基因序列被划分为4个家族，家族Ⅰ包含14条序列，约占序列总数的31.82%，家族Ⅱ包含9条序列，约占序列总数的20.45%，家族Ⅲ包含14条序列，约占序列总数的31.82%，家族Ⅳ包含7条序列，约占序列总数的15.91%（图4）。结合图2推测不同程度的点突变和碱基替换引起家族间及家族内的差异，最终导致果蔗品种Ty3-gypsy类反转录转座子具有较高异质性及多拷贝性。

2. 4 RT基因编码的氨基酸序列分析结果

对44条RT基因编码的氨基酸序列进行多重比对分析，结果（图5）发现有20条序列存在1～14个无义突变。发生1个无义突变的分别是SoRT4-21（第137个aa）、SoRT4-23（第30个aa）和SoRT4-30（第116个aa）、SoRT4-47（第43个aa）;发生2个无义突变的分别是SoRT4-8（第65、129个aa）和SoRT4-10（第65、129个aa）;发生4个无义突变的是SoRT4-4（第23、56、131、133个aa）：发生5个无义突变的分别是SoRT4-33（第30、52、108、121、125个aa）和SoRT4-48（第70、87、95、99、107个aa）;发生6个无义突变的分别是SoRT4-26（第23、68、93、97、105、125个aa）、SoRT4-42（第71、88、96、100、108、125个aa）、SoRT4-44（第23、68、93、97、105、125个aa）和SoRT4-50（第23、92、93、97、105、125个aa）;发生7个无义突变的是SoRT4-29（第107、108、109、117、121、128、135个aa）;发生8个无义突变的分别是SoRT4-4（第77、87、88、101、108、121、123、128个aa）、SoRT4-34（第23、54、92、93、97、105、125、140个aa）和SoRT4-38（第23、44、68、93、97、105、125、140个aa）;发生10个无义突变的是SoRT4-20（第88、95、96、103、104、117、127、130、134、137个aa）;发生无义突变最多的是SoRT4-5和SoRT4-28，均达到了14个，SoRT4-5突变位点分别是在第23、25、26、29、41、69、90、97、105、112、114、122、129和141个aa，SoRT4-28突变位点分别是在第11、29、33、35、41、54、58、105、106、114、119、122、130和136个aa;SoRT4-29发生了3个连续无义突变。推测无义突变引起反转录转座子失去转录活性，导致果蔗品种拔地拉Ty3-gypsy类反转录转座子表现出较高异质性和多拷贝性。

根据44条RT基因核苷酸序列的聚类分析结果，选择各家族中的代表序列，预测其编码蛋白的二、三级结构，结果（表2）显示，这些蛋白的二级结构含有5个α-螺旋、8或9个β-折叠;三级结构含有转角16～19个及氢键68～94个，还含有明显的螺旋结构5个和折叠结构5个（红色为N端，蓝色为C端）。图6为家族Ⅰ中代表序列SoRT4-11编码蛋白的二、三级结构。

2. 5 RT基因编码蛋白的保守基序预测结果

由图7可知，44条RT基因编码的蛋白序列存在5种保守基序（Motif 1～Motif 5），其中，有29条序列同时包含Motif 1、Motif 2、Motif 3和Motif 4，约占序列总数的65.91%，尤其是Motif 1在44条序列中均存在，高度保守，该保守基序决定了44条序列的编码基因均为RT基因;其余15条序列中，SoRT4-26、SoRT4-44、SoRT4-38、SoRT4-50和SoRT4-34这5条序列出现了不同的保守基序即Motif 5、SoRT4-33、SoRT4-48和SoRT4-42这3条序列的Motif 4均出现在序列下游。

2. 6 系统发育进化分析结果

将44条果蔗RT基因序列和GenBank中已发表的18条来源于单子叶、双子叶和裸子植物RT基因序列（表3）翻译成氨基酸序列，用于构建系统发育进化树（图8）。根据果蔗和其他植物RT基因编码的氨基酸序列，RT基因可划分为七类（Ⅰ～Ⅶ），Ⅰ类包含18条果蔗RT基因序列，Ⅱ类包含12条果蔗RT基因序列和拟南芥的BAB40828.1，Ⅰ类和Ⅱ类中的果蔗RT基因序列分别占到序列总数的40.91%和27.27%，表明果蔗RT基因序列的保守性较高;Ⅲ类中的14条RT基因序列均来自其他物种植物，但与Ⅰ类和Ⅱ类中的序列亲缘关系相对较近;Ⅳ类只包含SoRT4-20，Ⅴ类和Ⅶ类仅包含2条果蔗RT基因序列;Ⅵ类包含果蔗的7条RT基因序列及禾本科粳稻（Oryza sativa japo-nica，BAB40824.1）、藜科菠菜（Spinacia oleracea，BAB 40833.1）和豆科大豆（Glycine max，BAB40834.1）的RT基因序列，表明这些物种亲缘关系较近。

2. 7 RT基因序列的转录活性初步分析

将RT基因序列与甘蔗EST库进行比对，结果（表4）显示，当查询覆盖度均为87%时，SoRT4-40与GE325024.1和GE325034.1的一致性均为91.78%，暗示这2条EST序列为果蔗品种拔地拉Ty3-gypsy类反转录转座子的部分转录序列，推测SoRT4-40具有转录活性。

3 讨论

本研究发现，利用简并引物对PCR扩增同一种质，扩增出的目的条带是由很多条序列组成的混合体，长度约430 bp，与在其他作物中的扩增结果（侯小改等，2013;张文波等，2016;彭磊等，2017;白杨等，2018;王庆竹等，2018）一致，且这些Ty3-gypsy类反转录转座子RT基因序列在长度、碱基含量和核苷酸相似性上存在较大的差异，表现出较高异质性。另外，在核苷酸序列间相似性和无义突变发生率上，44条果蔗RT基因异质性较高，而在氨基酸序列相似性上，44条果蔗RT基因异质性更高。本研究44条果蔗RT基因编码氨基酸序列的主要保守基序为Motif 1～Motif 4，表明44条果蔗RT基因保守性较高，但有15条果蔗RT基因序列的保守基序变异较大，表明44条果蔗RT基因序列也存在一定程度的异质性。反转录转座子的转座高频突变、自然突变、同源重组及横纵向传递均会导致序列异质性的产生（阳太亿等，2019）。

本研究基于RT基因的核苷酸序列进行聚类分析，结果显示44条果蔗RT基因序列可划分为四大家族，主要家族是Ⅰ和Ⅲ，表明这些果蔗RT基因呈现一定程度的保守性，初步推测具有转录活性的家族是Ⅰ和Ⅲ，它们存在的历史愈久远（Tang et al.，2005）。另外，4个家族代表性RT基因编码的蛋白在氢键数量和转角数量等三级结构上存在差异，家族Ⅳ中的7条RT基因序列均存在多个无义突变，其中SoRT4-26的氢键数量明显少于其他3个家族中的代表性序列，而蛋白质结构的稳定性依靠氢键维持，推测该家族RT基因编码的蛋白已失去活性。

本研究系统发育进化树分析结果显示，Ⅱ类中的12条果蔗RT基因序列与拟南芥的BAB40828.1亲缘关系较近;Ⅵ类中的7条果蔗RT基因序列与粳稻的BAB40824.1、菠菜的BAB40833.1和大豆的BAB40834.1親缘关系最近，推测横向传递曾发生在果蔗Ty3-gypsy类反转录转座子与这些物种植物之间。Ⅳ类只包含SoRT4-20，Ⅴ类和Ⅶ类中的RT基因序列均来自果蔗，但所包含的RT基因序列较少，且这3类与其他家族的亲缘关系较远，推测这3类RT基因在起源和进化上较古老，为果蔗所特有，特异性较强。

4 结论

从果蔗品种拔地拉克隆获得44条Ty3-gypsy类反转录转座子RT基因序列，这些RT基因在序列长度、AT含量、核苷酸及氨基酸序列间相似性、无义突变发生率、保守基序异质性及蛋白结构上呈现出多样性，44条中的1条RT基因序列SoRT4-40具有转录活性。

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（責任编辑 陈 燕）