海来约布，群 培，卢君蓉，蒋敏桃，文 阳，马 权，盖荣银，李文兵，刘 圆

基于HPLC-ICP-MS的藏药佐塔汞、砷元素形态、价态分析及安全性评价

海来约布1, 2, 3，群 培1, 4#，卢君蓉5，蒋敏桃5，文 阳1, 2, 3，马 权1, 2, 3，盖荣银6，李文兵2, 3*，刘 圆2, 3, 7*

1.西南民族大学药学院，四川 成都 610225 2.四川省羌彝药用资源保护与利用技术工程实验室，四川 成都 610225 3.青藏高原民族药用资源保护与利用国家民委重点实验室，四川 成都 610225 4.西藏甘露藏药股份有限公司，西藏 拉萨 850000 5.成都中医药大学，四川 成都 611137 6.岛津企业管理（中国）有限公司，四川 成都 611900 7.西南民族大学民族医药研究院，四川 成都 610041

对藏药佐塔中汞、砷元素形态和价态进行分析，并结合其在复方制剂中用法用量进行安全性评价，以期为佐塔临床应用提供理论依据。采用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱（HPLC-ICP-MS）法测定佐塔在人工胃肠液汞、砷的形态和价态，并根据佐塔在藏药复方制剂中用法用量来计算可溶性汞、砷的摄入量。9批佐塔在人工胃肠液中以无机汞（Hg2+）、三价砷（AsIII）和五价砷（AsV）形式存在，其质量分数分别为11.25～725.13、6.68～67.53、36.06～289.03 μg/g，未检测出甲基汞（MeHg）、乙基汞（EtHg）、砷胆碱（AsC）、砷甜菜碱（AsB）、一甲基砷（MMA）、二甲基砷（DMA）。根据佐塔在藏药复方制剂最大日服量0.2 g计算，可溶性Hg、As的摄入量分别在2.3～145.0 μg和10.6～63.4 μg，在规范使用情况下，具有较高的临床安全性。

藏药；佐塔；汞；砷；价态；形态；摄入量；安全性评价

佐塔又称佐太、佐台，是以水银和硫黄为原料，辅以金、银、铁等8种金属与黄铜矿、银矿石、磁石等8种矿物及多种专用辅料炼制而成[1]，是藏药复方制剂中重要佐剂，被誉为“藏药之母本”“藏药宝中宝”。佐塔单用具有滋补强身、延年益寿、解毒排毒和活血、补血等功效，与其他藏药合用具有增效解毒作用[2-3]。由于佐塔制备过程中以水银为主要原料，并加入一定量的金属类和珍宝类藏药材，使其Hg、As等重金属及有害元素含量超标，其临床使用安全性问题一直是备受关注的焦点，也在一定程度影响了佐塔及其复方制剂的应用和推广。

现代研究表明，重金属及有害元素的毒性与其在机体内存在的化学形态密切相关[4]。如有机Hg因其具有亲脂性和生物放大效应，毒性大于无机Hg，其中生物毒性以甲基汞（MeHg）最大[5]；而无机As由于可溶性和迁移性更高，其毒性大于有机As，毒性由大到小依次为砷化氢（AsH3）＞三价砷（As III）＞五价砷（AsV）＞一甲基砷（MMA）＞二甲基砷（DMA）＞砷胆碱（AsC）＞砷甜菜碱（AsB）＞单质砷（As）[6]。因此，模拟人体胃肠环境，对佐塔中Hg和As的形态和价态进行研究，并结合其在藏药复方制剂使用量进行安全性风险评价，可为佐塔临床应用安全性提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

LC-20Ai型高效液相色谱仪、2030型电感耦合等离子体质谱仪，日本岛津公司；ME204E型电子天平，十万分之一，Mettler Toledo公司；SHA-C型水浴恒温摇床器，常州亿能实验仪器厂；1810A型摩尔原子型超纯水器，上海摩勒科学仪器有限公司；KQ5200DB型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；PHS-3C型PH计，上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.2 药物与试剂

1.2.1 试剂 胃蛋白酶（批号202003181）、胰酶（批号20203091）购于成都艾科达化学试剂有限公司；硝酸、盐酸、磷酸二氢钾、氢氧化钠均为优级纯；乙酸铵、-半胱氨酸、磷酸二氢铵、乙二胺四醋酸二钠均为分析纯，水为超纯水；人工胃液和人工肠液按照《中国药典》2020年版四部通则0921配制。

1.2.2 标准物质 MeHg溶液标准物质［批号GBW08675，（76.3±2.9）μg/g］、乙基汞（EtHg）溶液标准物质［批号GBW（E）081524，（73.8±2.7）μg/g］、MMA溶液标准物质［批号GBW08668，（46.2±1.5）μg/g］、DMA溶液标准物质［批号GBW08669，（0.706±0.024）μmol/g］、AsB溶液标准物质［批号GBW08670，（92.2±2.7）μg/g］、AsC溶液标准物质［批号GBW08671，（91.6±3.7）μg/g］均购于中国计量科学研究院；Hg元素标准物质（批号GSB- 04-1729-2004，1000 μg/mL）购于国家有色金属及电子材料分析测试中心；As元素标准物质（批号BWJ4223-2016，1000 μg/mL）购于北京世纪奥科生物技术有限公司；AsIII（批号158241-1，以As计，75.7 μg/g）、AsV（批号144014-6，以As计，17.5 μg/g）购于美国O2Si公司。

1.2.3 样品 不同批次佐塔样品（编号为ZT0901、ZT0902、ZT0903、ZT0904、ZT0905、ZT0906、ZT0907、ZT0908、ZT0909）分别由甘孜藏族自治州藏医院、西藏自治区藏医院、甘南藏族自治州藏医院、德格县藏医院、德格县宗萨藏医院、青海省藏医院、青海久美藏医院、青海塔尔寺藏医院、阿坝藏族羌族自治州藏医院提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 Hg形态 Shim-pack GlST C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.01 mol/L乙酸铵溶液（含0.12%-半胱氨酸，氨水调节pH值至7.5）（8∶92）；体积流量0.8 mL/min；柱温30 ℃。在选定条件下，3种不同形态Hg的分离度均大于1.5，色谱图见图1。

图1 不同形态Hg混合溶液(A)、佐塔样品(B) 和空白溶液(C) 的HPLC图

2.1.2 As形态 Hamilton PRP-X100阴离子交换色谱柱（250 mm×4.1 mm，10 μm）；流动相为0.025 mol/L磷酸二氢铵溶液（氨水调节pH值至8.0）-水，梯度洗脱：0～15 min，100%～0水；15～20 min，0～100%水；20～25 min，100%水；体积流量为1.0 mL/min；柱温为30 ℃。在选定条件下，6 种不同形态As的分离度均大于1.5，色谱图见图2。

2.2 质谱条件

高频功率1.20 kW，高频频率27.12 MHz，辅助气体积流量1.10 L/min，炬管类型Mini炬管，雾化室旋流，等离子体气体积流量9.0 L/min，载气体积流量0.70 L/min，碰撞气种类He气，采样深度5.0 mm，雾化室温度0 ℃（Hg）、5 ℃（As），能量过滤器电压5.0 V（Hg）、7.0 V（As），监测质量数202Hg和75As。

图2 不同形态As混合溶液(A)、佐塔样品(B) 和空白溶液(C) 的HPLC图

2.3 对照品溶液制备

2.3.1 不同形态Hg混合标准溶液 分别精密称取MeHg、EtHg、Hg2+标准溶液适量，加8%甲醇制成各含0.1 μg/mL（以Hg计）的混合溶液，用8%甲醇分别稀释制成0.5、1、2、5、10、20 ng/mL（以Hg计）的系列溶液。同法制备空白溶液。

2.3.2 不同形态As混合标准溶液 分别精密称取AsC、AsB、AsIII、DMA、MMA、AsV标准溶液适量，加水制成各含2.0 μg/mL（以As计）的混合溶液，以0.02 mol/L乙二胺四醋酸二钠溶液稀释成各含1、5、10、20、50、200、500 ng/mL（以As计）的系列溶液。同法制备空白溶液。

2.4 供试品溶液制备

2.4.1 Hg形态供试品溶液 取佐塔粉末约60 mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加人工胃液或人工肠液250 mL，密塞，称定质量，置37 ℃水浴中超声处理（功率300 W、频率45 kHz）2 h，放冷，再称定质量，用人工胃液或人工肠液补足减失的质量，摇匀，静置24 h，吸取中层溶液适量，滤过，精密量取续滤液2 mL，置10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4.2 As形态供试品溶液 取佐塔粉末约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加人工肠液250 mL，密塞，称定质量，置37 ℃水浴中超声处理（功率300 W、频率45 kHz）2 h，放冷，再称定质量，用人工肠液补足减失的质量，摇匀，静置24 h，吸取中层溶液适量，滤过，精密量取续滤液5 mL，置50 mL量瓶中，加0.02 mol/L乙二胺四醋酸二钠溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

2.5 线性关系及定量限考察

分别精密吸取不同质量浓度Hg、As混合标准溶液，精密吸取20 μL注入液相色谱仪，按相应色谱和质谱条件测定峰面积。以Hg、As各形态质量浓度为横坐标（），峰面积为纵坐标（），绘制标准曲线，计算回归方程。结果表明，3种Hg元素形态在0.5～20 µg/L，6种As元素形态在1～500 µg/L线性关系均良好，值均大于0.999 0。采用逐级稀释法对Hg、As标准溶液进行稀释，以信噪比（/）为10时相对应质量浓度为定量限，结果3种形态Hg定量限为0.08～0.11 µg/L；6种形态As定量限为0.09～0.23 µg/L，结果见表1。

表1 不同形态Hg、As线性回归方程及定量限

2.6 精密度试验

分别取1 ng/mL Hg和5 ng/mL As不同形态混合标准品溶液，在设定的HPLC-ICP-MS条件下，连续进样6次，以Hg、As各形态峰面积值计算RSD值。结果表明，Hg、As各形态峰面积的RSD分别为1.92%、2.15%，均小于3%，结果表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取佐塔样品（批号ZT0901），分别按“2.4”项方法制备供试品溶液，并于制备后0、2、4、8、12 h测定Hg（人工胃液）和As不同形态含量。结果表明，不同时间点Hg2+、AsIII、AsV质量分数RSD分别为1.07%、2.23%、1.97%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验

取佐塔样品（批号ZT0901）6份，分别按“2.4”项方法制备供试品溶液，按上述色谱和质谱条件分别测定Hg（人工胃液）和As不同形态含量。结果表明Hg2+、AsIII、AsV质量分数均值分别为147.65、10.55、42.30 µg/g，RSD分别为3.18%、4.07%、4.33%，均小于5%，说明重复性良好。

2.9 加样回收率试验

取重复性实验佐塔样品（批号ZT0901）适量，分别取30 mg和50 mg，各6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入5.00 μg/mL的Hg元素标准溶液、0.50 μg/mL的 AsIII标准溶液和2.00 μg/mL的AsV标准溶液各1 mL，按“2.4”项方法制备供试品溶液，按上述色谱和质谱条件分别测定Hg和As不同形态含量，计算加样回收率。结果表明，Hg2+加样回收率在88.26%～95.74%，RSD为3.13%；AsIII加样回收率在82.68%～98.59%，RSD为6.36%；AsV加样回收率在82.27%～93.75%，RSD为5.04%。

2.10 汞、砷形态及价态分析

取佐塔粉末适量，精密称定，按照“2.4”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱和质谱条件分别测定Hg和As不同形态及价态含量。结果表明，9批佐塔样品在以人工肠液为溶媒时，Hg2+质量分数为0.19～8.75 μg/g，以人工胃液为提取溶媒时，Hg2+质量分数为10.77～724.86 μg/g，总量在11.25～725.13 μg/g，均未检出MeHg和EtHg；9批佐塔样品在以人工肠液为提取溶媒时，AsIII和AsV质量分数分别在6.68～67.53 μg/g和36.06～289.03 μg/g，总量在52.85～317.13 μg/g，均未检出AsC、AsB、DMA、MMA，不同形态Hg测定结果见表2，As测定结果见表3。

2.11 佐塔安全性评价

佐塔在藏医临床使用过程中常与诸药相配，起到增强疗效，降低毒性的作用。对藏医临床以佐塔为辅剂的藏药制剂的调研发现，不同制剂中佐塔加入量不尽相同，根据其用法用量可得出不同藏药制剂中佐塔日服量在0.007～0.192 g，结果见表4。根据9批佐塔样品在以人工胃肠液为溶媒提取可溶性Hg和As总量（表2、3），并按佐塔最大日服剂量0.2 g推算机体通过胃肠摄入可溶性Hg和As的量分别在0.002～0.145 mg和0.011～0.063 mg，均值分别为0.057 mg和0.027 mg（表5）。与世界粮食及农业组织和世界卫生组织建议的Hg和As的每日允许摄入量（allowable daily intake，ADI）值0.043 mg和0.12～0.13 mg相比，9批佐塔样品可溶性As含量低于ADI值；可溶性Hg除ZT0903、ZT0905、ZT0907、ZT0908等批次外，其余均低于ADI值，说明不同藏医院生产佐塔质量差异较大。

3 讨论

本实验模拟人体胃肠环境研究佐塔中Hg、As形态及价态，以期为其临床用药安全性提供数据支撑。供试品溶液的制备方法参照《中国药典》2020年版四部通则2322汞、砷元素形态及价态测定法[13]进行，并在此基础上对供试品溶液的制备方法进行优化，考察了超声提取和震荡提取2种方法，对提取时间、静置时间进行筛选，结果表明以37 ℃水浴中超声处理2 h，静置24 h效果最佳。

表2 佐塔中不同形态Hg含量测定结果(n = 3)

“−”未检出，下表同

“−” not detected, same as below

表3 佐塔中不同形态As含量测定结果(n = 3)

表4 含佐塔藏药制剂规格及用法用量情况

9批佐塔中As元素均以AsIII和AsV形式存在，总量在52.85～317.13 μg/g，按佐塔最大日服剂量0.2 g推算机体摄入可溶性As的量为0.011～0.063 mg，低于FAO和WHO建议的As元素ADI值；Hg元素以毒性较小的无机汞（Hg2+）形式存在，未检出毒性较大的有机汞（MeHg和EtHg），虽部分批次可溶性Hg量略超ADI值，但结合课题组前期研究结果及佐塔毒理研究的有关报道[14-16]，佐塔仅在超剂量或长期用药（30 d以上）时，Hg才在动物主要脏器内蓄积，但均未表现出明显的不良反应。在藏医临床，佐塔一般以佐剂的形式在复方中于治疗中风、麻痹病、高血压、神经系统[17]等疾病，其临床用药周期最长为1个月[18]。因此，在藏医临床指导下规范使用佐塔，具有较高的安全性。

表5 含佐塔制剂每日Hg、As最大摄入量

不同批次佐塔样品在人工胃液中Hg2+含量（10.77～724.86 μg/g）远高于人工肠液含量（0.19～8.75 μg/g），这主要与佐塔主要成分为HgS有关。在酸性条件下，HgS可部分被转化为可溶性Hg2+，而在碱性条件下，HgS较为稳定，从而导致人工胃液中Hg2+的含量远高于人工肠液。佐塔是以剧毒水银为原料，炮制过程中需经复杂的水银洗炼法祛污祛毒后才能达到降低毒性的作用，其中湿法洗炼是用童子尿等液体辅料反复洗炼水银，以除去其中可溶性Hg盐，如Hg(SCN)2、Hg(NO3)2等[19]。由于不同藏医院水银洗炼工序所有辅料、洗炼顺序和次数等不尽相同，使可溶性Hg盐祛除程度不一，从而导致不同藏医院炮制佐塔可溶性Hg2+差异较大。因此，在佐塔炮制工艺高度保密的情况下，通过测定其人工胃肠液中Hg2+含量，可作为评价佐塔炮制工艺的是否规范合理的标准之一。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Safety evaluation, elemental speciation and valence state analysis of mercury and arsenic of Tibetan medicine Zuota based on HPLC-ICP-MS

HAILAI Yue-bu1, 2, 3, QUN Pei1, 4, LU Jun-rong5, JIANG Min-tao5, WEN Yang1, 2, 3, MA Quan1, 2, 3, GAI Rong-yin6, LI Wen-bing2, 3, LIU Yuan2, 3, 7

1.College of Pharmmacy, Southwest Minzu University, Chengdu 610225, China 2.Sichuan Qiang-Yi Medicinal Resources Protection and Utilization Technology Engineering Laboratory, Chengdu 610225, China 3.Key Laboratory of Tibetan Plateau Ethnic Medicinal Resources Protection and Utilization of National Ethnic Affairs Commission, Chengdu 610225, China 4.Tibet Ganlu Tibetan Medicine Co., Ltd., Lasa 850000, China 5.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 6.Chengdu Shimadzu Instrument Equipment Co., Ltd., Chengdu 611900, China 7.Ethnic Medicine Institute, Southwest Minzu University, Chengdu 610041, China

To analyze the elemental speciation and valence state of mercury and arsenic in the Tibetan medicine Zuota, and evaluate its safety combining with its preparation’s usage and dosage, so as to provide theoretical basis for its clinical application.The HPLC-ICP-MS method was used to detect the elemental speciation and valence state of mercury and arsenic in Zuota in artificial gastric and intestinal juice.The intake of soluble mercury and arsenic was calculated according to the usage and dosage of Zuota in its preparation.By detecting nine batches of Zuota, the result showed that the elemental speciation of mercury existed in artificial gastric and intestinal juice was inorganic mercury.The valence state of mercury was divalent mercury (Hg2+), and the content of it was 11.25—725.13 μg/g.The elemental speciation of arsenic existed in artificial gastric and intestinal juice was organic arsenic.The valence state of arsenic were trivalent arsenic (AsIII) and pentavalent arsenic (AsV), and the content of them were 6.68—67.53 μg/g and 36.06—289.03 μg/g respectively.What’s more, methylmercury (MeHg), ethylmercury (EtHg), arsenic choline (AsC), arsenic betaine (AsB), monomethyl arsenic (MMA), and dimethyl arsenic (DMA) were not detected in it.The maximum daily dose of Zuota in its preparation is 0.2 g.So the intake of soluble mercury and arsenic would be calculated as 2.3—145.0 μg and 10.6—63.4 μg respectively every day.Thus, the use of Zuota in clinic would be with highly safety.

Tibetan medicine; Zuota; mercury; arsenic; elemental speciation; valence state; intake; safety evaluation

R283.6

A

0253 - 2670(2022)10 - 2985 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.10.007

2021-10-29

国家重点研发计划项目（2018YFC1708005）；四川省药品监督管理局项目（510201201810173）；中央高校基本科研业务费专项资金研究类项目（2021PTJS35）

海来约布（1994—），男，彝族，硕士研究生，研究方向为民族药品种、质量与资源开发。E-mail: 1157820560@qq.com

通信作者：李文兵（1988—），男，博士，副研究员，研究方向为民族药炮制工艺及质量标准研究。Tel: 13540876731 E-mail:285892232@qq.com

刘 圆（1968—），女，博士生导师，教授，从事少数民族药物研究和教学。Tel: (028)85528812 E-mail: 499769896@qq.com

#共同第一作者：群 培（1993—），男，藏族，硕士研究生，研究方向为民族药品种、质量与资源开发。E-mail: 1679231848@qq.com

[责任编辑 郑礼胜]