赵烨清+石莉+欧阳臻+闻崇炜

摘要：恰当的细胞破碎工艺是获取胞内蛋白质的必需环节，然而现有细胞破碎技术仍有较多不足。为了研究合适的细胞破碎方法，拟通过化学法与渗透压法的联用，建立化学-渗透压法温和高效破碎大肠杆菌细胞的新工艺。结果表明：（1）单用化学法处理大肠杆菌细胞，最高仅能释放37.3%的胞内蛋白质，而化学-渗透压法最高可以释放842%的胞内蛋白质；对渗透压处理环节进行优化后，胞内蛋白质释放率提高至93.1%及以上；（2）以优化的化学-渗透压法释放重组原动蛋白2β（PK2β）工程菌细胞的胞内蛋白质，其中70.5%～80.2%重组PK2β呈可溶性，而超声法处理的样品中不含有可溶性重组PK2β，表明化学-渗透压法不仅简便高效、成本低廉，而且有利于保留可溶性重组蛋白质，而超声破碎法会导致可溶性蛋白发生变性沉淀而增加蛋白质分离的难度。综合分析可知，化学-渗透压法在基因工程及生物工程中具有良好的应用前景。

关键词：化学-渗透压法；细胞破碎；温和高效；胞内蛋白质；可溶性

中图分类号： Q939.97 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）19-0146-04

收稿日期：2016-05-04

基金项目：国家自然科学基金（编号：81573529）；江苏大学高级人才启动基金（编号：1281370001）；江苏省2015年度普通高校研究生实践创新计划（编号：SJLX15_0512）；江苏大学第14批大学生科研立项项目（编号：14A441）。

作者简介：赵烨清（1992—），女，江苏南通人，硕士研究生，主要从事食源性功能肽的研发工作。E-mail：18796020517@163.com。

通信作者：聞崇炜，博士，副教授，主要从事食源性功能肽的研发工作。E-mail：wenchw@ujs.edu.cn。 大肠杆菌（Escherichia coli，简称E. coli）是基因工程与生物工程中表达重组蛋白质最常用的宿主菌。重组蛋白质通常被表达在E.coli胞内，必须进行细胞破碎后才能进行相应的分离纯化[1]。现有的细胞破碎方法分为机械法、化学法、物理法及生物酶法四大类，在实际应用中这些方法仍有较多不足。例如，机械法破碎效率高，但是需要高速珠磨机、高压匀浆机等贵重设备，同时由于发热大，可能重组蛋白质的生物活性[2-3]；化学法简便，但所用有机溶剂及变性剂也可能影响重组蛋白质的生物活性[4-5]；物理法条件温和，但破碎效率较低[6]；生物酶法条件温和、破碎效率较高，但碎菌成本较高[7]。因此可见，开发温和且具有高破碎效率的简便工艺在基因工程及生物工程中有较高的应用价值。

形态结构学研究表明，E. coli细胞壁是由脂多糖层、磷脂层与肽聚糖层组成的复合结构，具备较强的抗拉伸与抗剪切能力。渗透压法利用渗透压差破碎细胞，条件温和，可以很好地保留蛋白质的生物活性，但是作用力较弱，不足以完全破碎E. coli细胞壁，目前仅用于释放出周质空间的蛋白质[8]。本试验拟研究将化学法与渗透压法联用（本研究均简称为化学-渗透压法），从而实现既高效彻底破坏E. coli细胞壁，又完全释放胞内蛋白质，同时能保留蛋白质生物活性的可能性。本研究为该法处理E. coli BL21（DE3）、重组原动蛋白2β（PK2β）工程菌的试验结果。

1 材料与方法

1.1 材料

E. coli BL21（DE3）为笔者所在研究室保存，重组质粒pET-28-PK2β为笔者所在研究室构建，按常规方法转化获得相应重组工程菌[9]。

蛋白胨、酵母膏，购自Oxoid公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、考马斯亮蓝、卡那霉素、二硫苏糖醇（DTT），购自BBI公司（Bio Basic Inc.）；溴酚蓝，购自AMRESCO公司；十二烷基硫酸钠（SDS）（生物技术级），购自Merck公司；丙烯酰胺（超级纯）、N，N′-亚甲基双丙烯酰胺（超级纯）、乙二胺四乙酸（EDTA，分析纯），购自生工生物工程（上海）股份有限公司；Triton X-100（化学纯），购自国药集团化学试剂有限公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸、过硫酸铵、N，N，N′，N′-四甲基乙二胺、乙醇、冰醋酸等其他试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；琼脂粉（进口分装），购自中国医药（集团）上海化学试剂公司；蛋白分子量标准SpectraTM Multicolor Broad Range Protein Ladder，购自MBI公司，含有10、15、25、35、40、50、70、100、140、260 ku的条带。

1.2 试验方法

1.2.1 大肠杆菌培养和收集 E. coli BL21（DE3）采用一步法培养：将E. coli BL21（DE3）甘油菌冻存液按1‰比例接种到新鲜LB培养基（含1%蛋白胨、0.5%酵母膏、1% NaCl）中，37 ℃、250 r/min过夜培养15 h。培养液于10 000 r/min离心5 min，弃上清，菌体保存于-20 ℃备用。

重组PK 2β的E. coli BL21（DE3）工程菌采用两步法培养：取3 μL重组工程菌冻存液接种到3 mL新鲜LB培养基（含50 μg/mL卡那霉素）中，37 ℃、250 r/min过夜培养15 h获得种子。随后将种子液按照1%比例接种到新鲜LB培养基（含50 μg/mL卡那霉素）中，37 ℃、250 r/min继续培养至D600 nm达到0.6左右，加诱导剂后继续振荡培养4 h。培养液于10 000 r/min离心5 min，弃上清，菌体保存于-20 ℃备用。

1.2.2 常规化学-渗透压法 包括化学法预处理、渗透压法2个环节，具体操作如下：（1）称取适量冻存E. coli菌体，按每30 mg菌体分别加入1 mL EDTA碎菌液或2.5 mL Triton X-100 碎菌液，4 ℃混匀过夜，然后于10 000 r/min离心 5 min，收集菌体备用；（2）取上述化学法预处理所得菌体，按每30 mg菌体加1 mL高渗液的比例重悬，室温放置20 min，8 000 r/min 离心10 min，再按每30 mg菌体加1 mL低渗液的比例重悬，室温放置20 min，8 000 r/min离心10 min；（3）继续按步骤（2）重复处理残留菌体2～4次。分别收集所得上清与沉淀菌体，待分析。endprint

化学预处理液含适量EDTA或Triton X-100，0.05 mol/L Tris·HCl（pH值8.0）及0.10 mol/L NaCl。低渗液含0.02 mol/L Tris·HCl（pH值 8.0）、0.002 5 mol/L EDTA（pH值8.0）。在低渗液中加20%蔗糖作为渗透压稳定剂，即得高渗液。

1.2.3 改进化学-渗透压法 具体操作流程同“1.2.2”节；化学预处理液成分同“1.2.2”节；低渗液成分同“1.2.2”节；高渗液中改用35%蔗糖或20%PEG 8000为渗透压稳定剂。

1.2.4 超声破碎法 按吴蕾等所述流程[10-11]并略作修改：取50 mg菌体重悬于预冷的低渗液中，冰浴中用超声破碎仪（购自宁波新芝生物科技股份有限公司）处理（功率300 W，每次超声破碎25 s，暂停25 s，超声20次）。取适量样品于 13 000 r/min 离心10 min，分出上清与沉淀，待分析。

1.2.5 蛋白质电泳 按常规方法[12]进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析，其中浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为10%。电泳结束后凝胶用考马斯亮蓝R250染色，脱色后的凝胶用成像系统拍照保存待分析。

1.2.6 胞内蛋白质释放率计算 样品中蛋白质含量与电泳对应条带及染色后条带深浅呈线性关系，因此可通过分析染色后条带的灰度值计算蛋白质含量[13]。SDS-PAGE凝胶图像用Quantity OneTM v 4.5软件（购自Bio-Rad Laboratories Inc.）进行各条带的灰度值分析定量，按照以下公式計算胞内蛋白质释放率：胞内蛋白质释放率=上清蛋白灰度值×上清稀释倍数上清蛋白灰度值×上清稀释倍数+沉淀蛋白灰度值×沉淀稀释倍数×100%。

1.2.7 大肠杆菌菌落形成单位（colony forming unit assay，简称CFU）检测 参照Sahoo等所述流程并略作修改：用含有1.5%琼脂粉的新鲜LB固体培养基（含 50 μg/mL 卡那霉素）制备平板，将对照菌液与化学-渗透压法处理所得菌液适当稀释后涂平板，于37 ℃培养箱倒置培养 16 h，取出平板，计算所得菌落数量[14-15]。

1.2.8 大肠杆菌形态观察 E. coli细胞按邹如意等所述方法[16]进行固定，用扫描电镜技术（scanning electron microscope，简称SEM）直接观察E. coli细胞处理前后的形态，所用仪器为日立公司的S-4800型场发射扫描电子显微镜，放大倍数为2 000倍。

2 结果与分析

2.1 化学法预处理E. coli菌体

按“1.2.2”节所述，用10～30 mmol/L EDTA与0.25%～1.25% Triton X-100预处理E. coli菌体，结果表明，以上2种试剂分别可以释放出2.42%～11.8%与12.5%～37.3%的胞内蛋白质，25 mmol/L EDTA与1.00% Triton X-100为各组的较优处理（图1）。EDTA与Triton X-100分别为温和的螯合剂与表面活性剂，分别作用于细胞壁中的脂多糖层与磷脂层。由图1还可以看出，Triton X-100的释放率高于EDTA，可能因为EDTA除去脂多糖层后，磷脂层仍保持完整，胞内蛋白质不易透过；而Triton X-100除去磷脂层后，脂多糖层有较多间隙，胞内蛋白质较易透过。

2.2 常规化学-渗透压法破碎E. coli菌体

为了提高胞内蛋白质释放率，将化学法预处理法与常规渗透压法联用，以20%蔗糖为渗透压稳定剂，进行3次渗透压法处理。结果表明，化学法预处理提高了后续渗透压法的破碎效率，不仅释放出E. coli周质空间的蛋白质，而且释放出大量胞内蛋白质。其中，EDTA+20%蔗糖处理可释放出 16.9%～35.7%的胞内蛋白质；Triton X-100+20%蔗糖处理可释放出37.6%～84.2%的胞内蛋白质；25 mmol/L EDTA与1.00% Triton X-100分别为各组的较优处理（图2）。形态结构学研究表明， E. coli 细胞具有外膜、 内膜的双层膜结构，影响了高渗液与低渗液进入细胞内部，因此单用渗透压法不能完全破碎细胞。而化学法预处理可以使外膜与内膜产生缺陷，有利于随后的高渗液、低渗液迅速进入细胞，细胞来不及发生相应形变而被完全破碎。

2.3 改进的化学-渗透压法破碎E. coli菌体

改进渗透压稳定剂与增加处理次数可以提高渗透压法碎菌的效率，因此，分别配制含有35%蔗糖、20% PEG 8000、20% PEG 4000的高渗液进行细胞破碎。如图3所示：各高渗液的碎菌效率排序依次为35%蔗糖、20%PEG 8000>20% PEG 4000>20%蔗糖；5次渗透压法碎菌效率比3次渗透压法高6.9%～46.7%。

综上所述，化学-渗透压法的最优条件为25 mmol/L EDTA预处理E. coli菌体，再以35%蔗糖或20% PEG 8000为渗透压稳定剂进行5次渗透压法处理；或以1%Triton X-100预处理E. coli菌体，再以35%蔗糖或20%PEG 8000为渗透压稳定剂进行3、5次渗透压法处理，胞内蛋白质释放率分别可以达到93.1%、100.0%。

2.4 改进的化学-渗透压法破碎重组PK2β工程菌

以上述改进的化学-渗透压法处理重组PK2β工程菌，对SDS-PAGE凝胶进行定量分析表明，25 mmol/L EDTA +35%蔗糖、25 mmol/L EDTA +20% PEG 8000处理分别可以释放96.4%、91.3%的胞内蛋白质；1% Triton X-100 +35%蔗糖、1% Triton X-100+20% PEG 8000处理分别可以释放99.0%、94.3%的胞内蛋白质；以超声破碎法处理重组工程菌，胞内蛋白质释放率为92.5%。因此可见，改进的化学-渗透压法的破碎效率与目前常用的超声破碎法相当。endprint

SDS-PAGE结果还显示，化学-渗透压法破碎工程菌后所得上清及沉淀中均含有重组PK2β，上清中含有的可溶性重组PK2β占总量的70.5%～80.2%；而在超声破碎法中，处理相同样品后，重组PK2β均在沉淀中，上清中未见可溶性重组PK2β（图4）。由此表明，超声破碎法不仅损伤重组蛋白质[17]，同时会使可溶性重组蛋白质变性沉淀，从而增加后续蛋白质分离的难度。

以菌落形成单位（CFU）检测与扫描电子显微镜（SEM）观察化学-渗透压法处理对工程菌细胞的影响。菌落数量检测结果表明，化学-渗透压法处理后样品所产生的克隆数仅为对照组的1%以下，表明该方法可以完全破碎工程菌细胞。SEM结果显示，破碎前大肠杆菌细胞形态完整，而化学-渗透压法处理后大肠杆菌几乎完全被破碎，留下很多无定形细胞残片；超声法处理后大肠杆菌发生断裂，留下很多短棒状细胞残片（图5）。由此表明，化学-渗透压法与超声法的碎菌机制不同，从而产生不同的破碎效果。

3 讨论与结论

温和高效地破碎大肠杆菌细胞是获取其胞内蛋白质的必经流程，但现有的细胞破碎工艺仍有较多不足，影响了基因工程及生物工程的发展。为了便于后续分离及获取有生物活性的重组蛋白，目前常用共表达分子伴侣蛋白质、二硫键异构酶或脯氨酸异构酶，或构建带金黄色葡萄球菌蛋白A、谷胱甘肽-S-转移酶、大肠杆菌麦芽糖结合蛋白malE、大肠杆菌硫氧还蛋白的融合蛋白以提高重组蛋白质的可溶性[18-21]。本研究结果表明，即使有可溶性蛋白表达出来，超声破碎法也可能导致可溶性蛋白质被变性沉淀， 从而使后续分离复杂化并

需要额外的复性环节。

本研究建立的化学-渗透压法具有简便高效、成本低廉、易于操作及放大的优点，可以完全破碎重组PK2β工程菌细胞，并且获得70.5%的可溶性重组PK2β，为后续大量制备该蛋白提供了便利。同时该法也可用于破碎其他工程菌细胞，有利于保持其他可溶性重组蛋白质的活性，因此在基因工程及生物工程中具有良好的应用前景。

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