李鹏飞 罗家伟 康丽华 张国伟 茅馨木 吴安然 张文怡 管怀进

迄今为止，年龄相关性白内障(ARC)的发病机制仍未完全清楚。研究证实，紫外线(UVB)辐射所造成的氧化损伤与ARC的发生发展紧密相关[1]。这种氧化损伤首先累及晶状体上皮细胞(LEC)，造成细胞内DNA和细胞膜质子泵受损，从而激活细胞凋亡途径。由于晶状体本身存在一定的损伤修复机制，只有细胞内损伤性DNA累积到一定程度时，才会引起LEC凋亡[2]。因此，DNA的损伤修复能力对LEC的存活至关重要。我们前期研究已证实，8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1(OGG1)基因能通过碱基切除修复(BER)通路特异性去除DNA双链中的8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)，参与受损DNA的修复过程[3]。现有的研究结果显示，OGG1基因的突变与老化和各种退行性疾病的发生密切相关，也可能参与ARC的发生发展过程[4-6]。本研究以人LEC(SRA01/04细胞株)为研究对象，采用UVB照射细胞模拟氧化损伤环境，探讨OGG1对UVB诱导损伤的LEC的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料SRA01/04细胞株购自中国科学院上海生命科学研究所。细胞培养实验用品包括：DMEM培养液、胎牛血清、胰蛋白酶和细胞培养板(均购自美国Gibco公司)。手持UVB检测灯购自上海光豪分析仪器公司；逆转录试剂盒购自美国Thermo Scientific公司，Trizol试剂盒购自美国Invitrogen公司，引物购自中国生工生物工程股份有限公司；靶向OGG1设计的siRNAs购自中国锐博生物科技有限公司；CCK8试剂盒购自日本同仁化学研究所；GAPDH抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔和山羊抗鼠IgG二抗均购自中国ABclonal公司，BAX、BCL-2和15A3抗体均购自英国Abcam公司。

1.2 细胞培养和UVB处理将冻存的SRA01/04细胞复苏后，加入完全培养基(含体积分数10%胎牛血清和10 g·L-1青链霉素的DMEM)进行常规培养。将培养瓶置于37 ℃含体积分数5% CO2细胞培养箱中继续培养。待细胞融合度达80%时，用Hanks液清洗细胞2次，加入适量的无菌PBS，置于紫外灯下30 cm处进行照射。将细胞分为UVB组和对照组，UVB照射时间分别为0 min(对照组)、10 min、15 min、30 min、45 min。照射后，加入完全培养基，继续培养24 h后进行后续实验。

1.3 实时荧光定量-PCR检测根据Trizol试剂盒说明书的操作步骤提取本实验的总RNA。按照说明书设定逆转录反应体系和反应时间。以GAPDH为内参，比较各组细胞目的基因和相应内参的Ct值，采用2-△△Ct分析目的基因表达情况，实验均重复3次。OGG1引物序列：上游为5’-TCCCGGTCTTCCTGATTAGC-3’，下游为5’-TACAAGAACTGGAGCACCGT-3’；GAPDH引物序列：上游为5’-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3’，下游为5’-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3’。

1.4 细胞转染及分组利用siRNA敲降技术针对靶基因OGG1设计3个siRNA(分别为siOGG1#1、siOGG1#2和siOGG1#3)。同时，为了验证出敲降效率最高的siOGG1，依据转染情况将细胞分为siOGG1#1组、siOGG1#2组、siOGG1#3组、siNC组和空白对照组(不转染)，实时荧光定量-PCR检测各组细胞中OGG1 mRNA的相对表达量。后续为了验证OGG1的表达下降对氧化损伤环境下细胞的作用，将细胞分为空白对照组、UVB组、UVB+siNC组和UVB+siOGG1#2组，观察各组细胞凋亡相关蛋白的表达变化。具体实验方法如下：首先，将细胞均匀接种至6孔板内，待细胞密度合适后，每孔中加入Lipofectamine 3000和siRNA充分混匀，室温孵育15 min。之后，放入培养箱中孵育细胞6 h后，将细胞培养基更换为含有血清的全培养基，并置于培养箱中继续培养48 h，采用UVB照射细胞，照射后继续培养24 h，提取蛋白，免疫印迹实验检测各组细胞中OGG1蛋白表情况。

1.5 免疫荧光法检测细胞DNA氧化损伤转染siOGG1#2后经UVB照射，观察细胞内DNA氧化损伤程度的变化情况，检测方法参考前期研究[7]。将细胞接种至细胞培养板，根据实验设计分为UVB+ siNC组和UVB+siOGG1#2组，之后对细胞进行siRNAs靶向干预和UVB处理。孵育24 h后，用PBS清洗细胞。随后加入40 g·L-1多聚甲醛，室温固定30 min。配制30 g·L-1牛血清白蛋白+体积分数0.5%Triton X-100溶液，室温封闭2 h。之后，根据抗体15A3(染色反应底物是8-oxoG，它是OGG1的修复作用靶点)说明书的比例用10 g·L-1牛血清白蛋白配制一抗反应液，置于4 ℃冰箱内孵育过夜。次日，洗涤后避光，加入配置好的荧光二抗，室温下孵育2 h。加Hoechst(110 000)避光孵育8 min染细胞核。最后，采用荧光显微镜避光拍摄。

1.6 CCK8实验检测细胞活力将细胞接种于96孔板，每孔10×103个细胞，置于培养箱培养24 h；根据实验需要将细胞分为空白对照组、UVB组、UVB+siNC组以及UVB+siOGG1#2组，每组设置6个平行孔，弃培养基，向每孔加入100 μL完全培养基和10 μL CCK8溶液；继续置于培养箱孵育1～2 h(操作过程注意避光)；使用酶标仪测定样品在波长450 nm处的吸光度。

1.7 免疫印迹实验检测蛋白表达从培养箱中取出已处理过的细胞，加入蛋白裂解液(CM/RIPA，1/100)，冰上裂解，提取上清；BCA法进行蛋白定量后，进行凝胶电泳(80 V转120 V)分离蛋白；采用湿转法转膜(250 mA，2 h)将靶蛋白转移至PVDF膜上；采用5 g·L-1脱脂牛奶，在室温下封闭2 h；参照目的抗体说明书将稀释好的目的一抗加入PVDF膜中，置于4 ℃冰箱进行孵育过夜。次日，用TBST漂洗，之后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔(二抗)进行室温孵育2 h。洗膜后加入显影剂，置于暗室内曝光显影。以GAPDH或α-tubline为内参，计算目的蛋白的相对表达量。

1.8 统计学方法采用SPSS 22.0统计学软件进行统计学分析。多组间比较采用单因素方差分析，两样本间比较采用t检验。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 UVB组和对照组细胞中OGG1的表达变化

2.1.1 UVB组和对照组细胞中OGG1 mRNA表达变化实时荧光定量-PCR检测结果显示：与对照组(UVB照射时间为0 min)相比，随着UVB照射时间的延长，细胞中OGG1 mRNA相对表达量先上升后下降，差异均有统计学意义(均为P<0.001)；UVB照射时间为10 min时，OGG1 mRNA的相对表达量最高(图1)。

图1 UVB组和对照组细胞中OGG1 mRNA相对表达量 与对照组相比，***P<0.001。

2.1.2 UVB组和对照组细胞中OGG1蛋白表达变化免疫印迹实验检测结果显示：UVB照射10 min时，OGG1蛋白相对表达量明显较其他照射时间组升高，且与对照组(UVB照射时间为0 min)相比升高显著(均为P<0.001)；随着UVB照射时间的延长，细胞内OGG1蛋白相对表达量呈时间依赖性下降(图2)。因此，本实验细胞氧化损伤模型采用UVB照射 10 min处理细胞。

图2 UVB组和对照组细胞中OGG1 蛋白相对表达量 与对照组相比，***P<0.001,ns示差异无统计学意义。

2.2 OGG1敲降模型验证实时荧光定量-PCR检测结果显示：与siNC组相比，靶向设计的转染siOGG1组的三个亚组中细胞OGG1 mRNA相对表达量均显著降低(均为P<0.001)，siOGG1#2组降低最为明显(图3)。此外，免疫印迹实验检测结果也证实：与siNC组相比，转染siOGG1#2后，OGG1蛋白水平的表达也显著降低。因此，选取siOGG1#2进行后续实验的OGG1敲降模型的制作。

图3 转染后各组细胞OGG1 mRNA相对表达量 与空白对照组相比，ns示差异无统计学意义；与siNC组相比，***P<0.001。

2.3 转染后经UVB照射各组细胞的状态变化

2.3.1 转染后经UVB照射各组细胞DNA氧化损伤程度变化免疫荧光染色结果显示：与UVB+ siNC组相比，UVB+ siOGG1#2组15A3(染色反应底物是8-oxoG，它是OGG1的修复作用靶点)染色阳性细胞明显增多(图4)。

图4 免疫荧光染色结果显示经UVB照射后UVB+ siNC组和UVB+ siOGG1#2组15A3染色阳性细胞变化

2.3.2 转染后经UVB照射各组细胞活力变化CCK8实验结果显示：与UVB+siNC组和空白对照组相比，UVB+siOGG1#2组细胞活力均明显降低，差异均有统计学意义(均为P<0.01)(图5)。

图5 转染后经UVB照射各组细胞活力变化 ns示差异无统计学意义,**P<0.01，***P<0.001。

2.3.3 转染后经UVB照射各组细胞凋亡相关蛋白BAX和BCL-2表达情况免疫印迹实验检测结果显示：与UVB+siNC组相比，转染后UVB+siOGG1#2组细胞促进凋亡的蛋白BAX表达明显增加，而抑制凋亡的蛋白BCL-2表达则明显下降(均为P<0.001)(图6)。

图6 转染后经UVB照射各组细胞凋亡相关蛋白BAX和BCL-2表达情况 ns示与 UVB组相比差异无统计学意义; 与空白对照组相比,**P<0.01，***P<0.001; 与UVB+ siNC组相比,###P<0.001。

3 讨论

ARC是白内障的主要类型之一，其病因目前仍不明确[8]。现阶段通过手术摘出混浊的晶状体仍是治疗ARC的主要方法。因此，探明ARC的病因及发病机制对其防治具有重要意义[8]。分子生物学研究表明，自由基和氧化应激导致的LEC内大分子物质(如DNA、RNA、脂质和蛋白质等)异常和细胞凋亡是ARC发病的病理基础[9]。研究发现，引起晶状体氧化损伤与应激的自由基来源有两类，一类是由外源性UVB等对晶状体组织长期刺激损伤所产生[10]；另一类则是由内源性的线粒体氧化呼吸链损伤所致[11]。本研究利用UVB处理人LEC，模拟ARC发生的氧化微环境，建立体外人LEC 氧化损伤的细胞模型，旨在寻找能有效抑制UVB所引起的细胞内DNA损伤的药物，减少LEC的凋亡。

LEC内DNA发生氧化损伤后，机体会自发启动DNA氧化损伤修复系统进行防御。研究发现，DNA氧化损伤修复主要有5种通路，包括BER、直接修复、核苷酸切除修复、错配修复和双链断裂修复通路[12]。上述任何一个DNA修复过程受到抑制均有可能导致细胞活力下降和凋亡发生。其中，BER通路是主要的DNA损伤修复通路[12-13]，该通路利用DNA糖苷酶识别并切除受损的核酸位点，并在DNA双链上形成去嘧啶位点(AP位点)；然后AP核酸内切酶在AP位点的5’端或者3’端切断DNA链产生裂口；最终通过DNA聚合酶和DNA连接酶合成新的片段并填补缺口，形成DNA新链[13-14]。此通路能否有效完成，主要取决于氧化损伤修复基因能否及时有效地修复受到破坏的DNA。而OGG1是BER通路中发挥修复功能的关键酶，其修复机制主要是靶向识别和切除受损DNA双链中氧化损伤的产物8-oxoG，从而修复其损伤，起到保护细胞的作用[15]。多项研究均已证实，OGG1基因的多态性与ARC易感性相关，有助于鉴定出ARC的高风险人群[16-17]。我们前期研究[18-19]发现，在三种轻度早期ARC患者样本中，OGG1基因和蛋白表达均显著升高，并且与8-oxoG的表达呈正相关。此外，OGG1基因的表达受其CpG岛和组蛋白区表观遗传修饰的动态调节。本研究中，我们首先以时间梯度采用UVB照射来诱导人LEC以构建细胞氧化损伤模型，模拟ARC中的氧化环境。结果发现，UVB照射10 min时，细胞中OGG1 mRNA和蛋白表达水平均显著升高。敲降OGG1表达之后，LEC内DNA氧化损伤标志物8-oxoG显著增加，说明OGG1参与LEC内受损DNA的修复过程。

研究发现，OGG1基因的失活或缺失能够抑制癌细胞的增殖，从而引起癌细胞凋亡，如乳腺癌、前列腺癌、肺磷癌等[20-21]。也有研究表明，OGG1可能是阿尔茨海默病和ARC等多种衰老性和退行性疾病潜在的生物标志物[4,22-24]。近年来，许多研究探讨了OGG1在ARC患者中的表达和功能机制。在敲除OGG1基因的斑马鱼氧化损伤模型中，研究表明，OGG1功能的丧失会加速ARC的发展进程[25]。同时，OGG1在过氧化氢诱导的氧化损伤模型中，对细胞的凋亡起调控作用，而针对UVB诱导的氧化损伤模型目前尚未见相关报道。本研究在UVB诱导的细胞氧化损伤模型中初步探讨OGG1功能机制，设计靶向OGG1的siRNA，发现OGG1修复能力的减弱会明显抑制LEC的细胞活力，从而导致细胞凋亡发生。

综上所述，本研究结果证实了OGG1基因在UVB诱导的细胞氧化损伤模型中通过BER通路参与受损DNA的修复过程，调控LEC内受损DNA的修复和细胞凋亡过程。