王富伟 ， 梁冰纯 ， 赵文鹏 ， 朱春燕 ， 高 健

( 1.中国农业大学动物医学院 ， 北京 海淀 100193 ； 2.北京首农畜牧发展有限公司 ， 北京 大兴 100076 ；3.上海市农产品质量安全中心 ， 上海 青浦 201708)

奶牛乳房炎是病原菌进入乳房内引起的乳腺组织炎症，可分为临床型乳房炎和隐性乳房炎[1]。隐性乳房炎(Subclinical mastitis,SCM)会导致奶牛的产奶量和繁育能力下降。由于没有明显的临床症状，无法及时治疗，因此，该病给规模化奶牛场带来了巨大的经济损失[2-3]。近年来，隐性乳房炎在亚洲国家的流行率已经超过50%[4]。河北省作为中国奶牛养殖的第三大省，也面临着隐性乳房炎高发的问题。葡萄球菌是一种革兰阳性菌，通常包括金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌(Coagulase negativeStaphylococci,CNS)(如产色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和溶血性葡萄球菌等)，在感染奶牛乳腺后会引发隐性乳房炎。目前，针对主要病原菌引起的隐性乳房炎采取的措施包括泌乳期治疗新发病例、淘汰慢性病例或干奶期治疗，均有助于降低传染性或环境性乳房炎的发病率，提高奶牛场效益[5]。随着细菌抗生素耐药性的增加以及超级细菌的出现，寻找替代疗法和改善防控措施至关重要。

1 材料与方法

1.1 试验对象 从河北地区19个规模化奶牛场(存栏600～2 500头)中随机抽取495头奶牛，采集1 819份乳区乳样，进行隐性乳房炎检测。

1.2 隐性乳房炎检测 用加州乳房炎检测法(CMT)进行测定。隐性乳房炎评判标准：奶样中体细胞数(SCC)0～20万/mL时为“-”；20万～50万/mL时为“±”；50万～80万/mL时为“+”；80万～500万/mL时为“++”；500万/mL以上时为“+++”。

1.3 收集奶样 弃去前3把奶，无菌收集奶样，样品采集后标明牛号及日期，4 ℃保存并尽快进行病原菌培养。

1.4 病原菌分离与鉴定 参照Gao等[6]的方法进行病原菌的分离与鉴定。

1.5 药物敏感性试验 采用纸片扩散法进行CNS的药敏试验。将分离得到的CNS分别接种至BHI培养基中摇床培养24 h(37 ℃，220 r/min)制成悬液，稀释至0.5麦氏浊度，用灭菌棉签蘸取适量菌液均匀涂布于LB琼脂培养基表面，贴药敏纸片(青霉素、头孢氨苄、头孢噻呋、克林霉素和万古霉素)。置于37 ℃恒温箱中培养24 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径(mm)。根据美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)(2017年)[7]药敏试验国标判定标准，分为敏感株(S)和耐药株(R)。

1.6 统计学分析 采用SPSS 22.0偏相关分析的方法对河北地区奶牛乳房炎的流行情况进行数据分析，P<0.05表示差异具有显著性。

2 结果

2.1 隐性乳房炎的乳区流行率 如图1所示，共检出隐性乳房炎阳性乳区乳样266份，乳区阳性率为15%；本试验调查的19个牛场中存栏、隐性乳房炎检测牛、检测乳区和隐性乳房炎阳性乳区数量这4个变量两两之间的关系，数据分析结果显示，存栏、隐性乳房炎检测牛、检测乳区和隐性乳房炎阳性乳区两两间不存在显著的相关关系(正相关和负相关)，即隐性乳房炎阳性乳区、检测乳区、隐性乳房炎检测牛和存栏量不会随存栏、隐性乳房炎检测牛、检测乳区和隐性乳房炎阳性乳区的增加(或减少)而增加(或减少)；但是在存栏和隐性乳房炎检测牛数一定的情况下，检测乳区和隐性乳房炎阳性乳区之间呈显著负相关(P=-0.061)。

图1 河北地区隐性乳房炎样本采集及检测情况

2.2 隐性乳房炎的病原菌分布 如图2所示，在266份隐性乳房炎阳性乳样中，检出CNS 95株(36%)、无乳链球菌18株(7%)、肺炎克雷伯菌17株(6%)、乳房链球菌15株(6%)、大肠埃希菌15株(6%)、棒状杆菌14株(5%)、停乳链球菌8株(3%)和其他病原菌10株(4%)；此外，混合感染18份(7%)、污染15份(6%)和无生长41份(15%)。

图2 不同感染类型奶样的阳性情况

2.3 隐性乳房炎级别与病原菌类型的相关性 CMT检测结果显示(表1)，在“+、++、+++”中，感染CNS样本量最多(49份、32份、14份)；其中，“+”占比最高(52%)，“+++”占比最低(15%)。在“+”中，感染停乳链球菌样本量最少(4份)；在“++”中，感染无乳链球菌样本量最少(2份)；在“+++”中，感染肺炎克雷伯菌、棒状杆菌和停乳链球菌样本量最少(0份)。在已检测出病原菌样本中，CNS、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌和棒状杆菌感染样本易呈“+”；乳房链球菌感染样本易呈“++”；无乳链球菌感染样本易呈“+++”。

表1 不同病原菌感染的体细胞评分情况

2.4 凝固酶阴性葡萄球菌耐药性 如图3所示，CNS对青霉素耐药率高达87%，对克林霉素(33%)、头孢噻呋(29%)和头孢氨苄(20%)耐药性较高，对万古霉素耐药率为7%。

图3 95株凝固酶阴性葡萄球菌对检测抗生素的耐药率

3 讨论

本试验结果显示，河北地区19个规模化奶牛场495头奶牛中隐性乳房炎乳区阳性率为15%。据高健[8]报道，2012年调查的8个河北地区规模化奶牛场228头奶牛中隐性乳房炎乳区阳性率为28.2%。由此可见，近年来河北地区隐性乳房炎乳区阳性率呈下降趋势。

本试验结果表明，CNS为河北地区隐性乳房炎的主要病原菌。2012年我国奶牛隐性乳房炎最主要病原菌为CNS、金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌[8]。在我国奶牛临床型乳房炎主要病原菌中，革兰阳性球菌分离率高于革兰阴性杆菌[6]。因此，革兰阳性球菌是河北地区隐性乳房炎的防控关键。

本次调查发现，CNS对青霉素有较高耐药率，对克林霉素、头孢噻呋、头孢氨苄耐药率其次，对万古霉素耐药率最低。据Cheng等[9]报道，2018年中国大型奶牛场CNS对苯唑西林(84%)和青霉素(62%)有较高耐药性。其中，恩诺沙星-苯唑西林-青霉素-四环素是CNS最常见的多重耐药模式。

在过去10年中，CNS已被许多国家认为是奶牛(尤其是头胎牛)乳房炎的主要病原菌，其中最常见的种类为产色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、拟葡萄球菌和木糖葡萄球菌[10-11]。据Qu等[11]报道，我国最常见的CNS为产色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌和表皮葡萄球菌。CNS主要引起隐性和轻度临床型乳房炎，相关病原菌可分为传染性和环境性两类[12]。其中，传染性病原菌来源单一，主要为患病牛的乳区，并通过媒介(奶衬、毛巾或挤奶工的手等)在奶牛之间传播；而环境性病原菌来源较广，包括牛舍、垫料、粪便、行走通道、奶牛皮肤等，但不会在奶牛之间传播。

由于河北地区隐性乳房炎主要病原菌为CNS，根据其特点，需从以下3个方面加强防控。首先，加强牛体卫生管理。奶牛乳头是病原菌入侵的主要端口，为了预防隐性乳房炎，需要对产后奶牛乳头进行严格消毒，例如使用纸巾或毛巾浸润消毒剂对产后乳头进行消毒。同时，要求挤奶工佩戴橡胶手套，并在挤奶前对奶杯进行清洁和消毒[13]。其次，加强环境卫生管理。由于环境中存在隐性乳房炎病原菌，因此需要注意对牛舍、卧床、垫料、饮水和奶厅的清洁消毒。最后，加强奶牛干奶期管理。通过使用乳头内封闭剂和干奶牛抗生素疗法，完善干奶牛营养与环境管理等，从而有效预防隐性乳房炎的发生。