何发明 ，彭良琼 ，隆汶君 ，张文华 ，＊

（1.四川大学皮革化学与工程教育部重点实验室，四川 成都 610065;2.四川大学制革清洁技术国家工程实验室，四川 成都 610065）

前言

随着科技和经济的发展，生产过程潜在的环境风险越发引起关注。针对化学物质和复杂的水环境，通常毒性测试的受试生物有蚤类[1]、鱼类[2]、水藻类[3]和发光细菌[4]。其中采用发光细菌进行生物毒性测试法以其操作简单、实验周期短、价格低廉等特点，于 1979 年 被美国检验和材料学 会（American Society for Testing and Materials）认定为“Microtox”测试 方 法 ， 并 相 继 成 为 GB/T 15441-1995 和 ISO 11348-3:1998 水质急性毒性检测 的标准方法，目前被广 泛 运用 于 化学品[5-6]、以及 食 品[7]、坯革[8]、土 壤[9]等复杂基质的急性毒性测定。由于活性菌密度会影响毒性测试的灵敏度和重现性，发光细菌法须用毒性参照物确定测试菌密度[10]。例如，ISO 11348-3 规定 K2Cr2O7为标准毒物，而我国国标以 HgCl2为标准毒物[11]。但无论是 Cr(VI)或 Hg(II)，特别是 Hg(II)，其自身毒性都比较大，对人体健康和环境安全可能造成危害，也提高了测试机构的日常管理成本[12-13]。因此，选用其他毒性参照物替代是很有必要的。

参比物质的选择原则为价格低廉，易溶解、形态稳定、对人和环境危害低[14]，为了排除颜色对发光强度测定可能带来的干扰，参比物质最好无色，因此有色的金属离子如 Cu(II)，Fe(II)，Fe(III)，Co(II)，Ni(II)均不适合作为参比物质。另外由于发光细菌有最适 pH 范围，例如明亮发光杆菌在 pH 4～9 范围内发光强度稳定[15]，因此参比物质在其 最 适 pH 范围内也应该形态稳定或单一。有研究表明，Zn(II)可以作为毒性参比物质直观地表征环境样品的毒性[16]，但是缺乏 Zn(II)的无机配体对其毒性测定的影响，也没有在检测标准中应用。因此本文针对 Zn(II)的无机配体 SO42-和 Cl-，研究了其对 Zn(II)的形态分布、存放稳定性和毒性的影响，选取了适当的参比替代，并采用此参比替代物质测试了常见鞣剂鞣制坯革的生态毒性。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

酵母浸粉、胰蛋白胨，购于北京博兴 生 物 技术有限公司；HgCl2，购于姜堰市环球试剂厂；ZnSO4·7H2O、ZnCl2、NaCl、Na2HPO4·12H2O、K2HPO4·3H2O、丙三醇均为分析纯，购于成都金山化学试剂 有限公司。明亮发光杆菌 T3 变种冻干粉，自制；鞣制坯革，自制，包括铬鞣革、甲醛鞣革、两性鞣剂 T 鞣革和有机膦鞣革。

Lumi Fox6000 生物毒性测试仪，ZWY-2012C恒温培养震荡箱，UV-1800BPC 紫外可见分光光度计 ，LDX-50KBS 高 压 蒸 汽 灭 菌 锅 ， 梅 特 勒FE20-Five Easy Plus TM pH 计，E3000YB 电子天平，CJ- 2FD 洁净工作台，Retsch SM 100 切割研磨仪。所用设备生产厂见文献[17]。

1.2 实验方法

1.2.1 发光细菌的培养

培养基按照文献[18]配置，将明亮发光杆菌冻干粉加入 3% NaCl 复苏，复苏后按照文献优化培养[18]，在第二次接种后培养 18 h，立即用于毒性测试。

1.2.2 Visual Minteq 模拟计算

模拟不考虑气相、氧化还原反应以及吸附反应，温度设置为 25 ℃，采用热力学平衡原理，硫酸锌和氯化锌的浓度设置为其对发光细菌的 EC50值[19]。各模拟体系离子强度 I＜＜4 mol/L。考虑到参比物质pH 的测试范围为 4～9，pH 扫描范围为 1～14。

1.2.3 菌密度的测定

取第二次接种后的新鲜菌液，加入 3%NaCl 溶液进行稀释，配置成不同菌密度的菌悬液。菌密度的测定方法见文献[10]，分别以 0.1 mg/L 的 HgCl2和EC50值的 ZnSO4溶液作为标准对照，测试其相对发光强度稳定在（50±10）%的菌密度范围。

1.2.4 参比物质生态毒性的测定

以 0.1 mg/L HgCl2作为标准对照样，以 3% NaCl作为标准空白样，每个浓度梯度设置三个平行，各浓度均采用 3%的氯化钠溶液配制。

1.2.5 鞣制坯革的生态安全性测定

参照文献[17]的方法制备坯革样品浸提液，抽滤，调节滤液 pH 为 7，加入 NaCl 使滤液的 NaCl 为 30 g/L，并用 30 g/L 的 NaCl 进行梯度稀释，然后选用替代参比物质作为标准对照，3%的 NaCl 作为空白对照，进行毒性测定。每个样品设置三个平行。

1.3 数据处理

采用 Origin 8.0 拟合样品浓度及相对发光强度获得剂量 - 效应曲线，计算其 EC50（明亮发光杆菌相对发光强度为 50%时的浓度）。高的 EC50值表明样品对发光细菌的毒性小。

2 结果与讨论

2.1 无机配体对溶液中锌离子形态分布的影响

运用 Visual Minteq 软件，基于热力学平衡，计算 ZnSO4和 ZnCl2中 Zn 的形态随 pH 变化的分布，结果见图 1 (a)，(b)。水溶液的模拟结果表明，ZnSO4和 ZnCl2中 Zn 主要存在形态一致，不受阴离子的影响。在 pH 1～7 范围内，锌以单核锌离子存在，其主要组分为约占 99%的 Zn(II)。但在 pH 7～14 范围内，锌的成分复杂且随 pH 增加主要成分变化较大。例如 pH 为 10 时，锌主要以 96%的溶胶态 Zn(OH)2(aq)存在；pH=12 时，锌主要以 67%的[Zn(OH)3]-存在，其次是 19%溶胶态 Zn(OH)2(aq)和 13%的[Zn(OH)4]2-。

图1 Zn 的形态随 pH 的分布a：1.23 mg/L 的 ZnSO4；b：0.92 mg/L 的 ZnCl2；c：1.23 mg/L 的 ZnSO4 +30 g/L 的NaCl；d：0.92 mg/L 的 ZnSO4 +30 g/L 的 NaClFig.1 The distribution of zinc species with pHa: 1.23 mg/L zinc sulfate; b: 0.92 mg/L zinc chloride; c: 1.23 mg/L zinc sulfate and 30 g/L sodium chloride; d: 0.92 mg/L of zinc chloride and 30 g/L of sodium chloride

考虑到明亮发光杆菌属于需盐菌，需要添加3%的 NaCl 才能维持其生长，在测试过程也需要维持 3%的渗透压，因此进一步计算了 ZnSO4和 ZnCl2在 30 g/L 氯化钠溶液中，Zn 随 pH 的形态分布，如图 1(c)，(d)。结果表明，盐介质对 ZnCl2的形态分布几乎没有影响，但 ZnSO4溶液的形态组分增加。ZnSO4的盐溶液在 pH 1～8 范围内，除了占比 65%的Zn2+，还有占比约 25%的 [ZnCl]+以及 5%的溶胶态ZnCl2(aq)和 3%的 Zn(OH)2(aq)，但这几种形态在 pH 1～8 范围内组成恒定。而 ZnCl2的盐溶液在 pH 1～8范围内成分仍为 99%的 Zn(II)。pH 8～14 范围内，Zn的成分复杂且随 pH 增加主要成分变化较大。例如pH 为 10 时，Zn 主要以溶胶态 Zn (OH)2(aq)（占比94%）存在，还有少量[Zn(OH)3]-（占比约 4%）；pH=12时，锌主要以[Zn(OH)3]-存在，占比 62%，其次是溶胶态 [Zn (OH)4]2-（占 比 24%）和 Zn (OH)2(aq)（占 比12%）。对比 c，d 在 pH 为 1～8 范围内的形态分布，其形态组成随 pH 结构单一，都可以作为毒性测试的参比物质。

2.2 无机配体对锌盐存放的稳定性影响

ZnCl2的吸湿能力极强，在空气中极易潮解[20]。因此，通过分析天平对ZnSO4和 ZnCl2的质量与时间的关系进行了研究，如图 2。结果表明，称取16.02 mg ZnCl28 min 后达到平衡为 17.18 mg，增长率为 7%，称量误差很大，会导致测试溶液的浓度偏低。而 ZnSO4的质量随时间几乎没有变化，因此 ZnSO4比 ZnCl2存放稳定性好。

图2 Zn(II)的存放稳定性Fig.2 Storage stability of zinc salts

2.3 硫酸锌和氯化锌的毒性

选用 HgCl2作为参比物质，测定了系列梯度浓度 ZnSO4比 ZnCl2的相对发光强度。结果如图 3 所示，随着 ZnSO4比 ZnCl2浓度的增加，相对发光强度降低，对明亮发光杆菌的毒性增加。根据 Origin8.0 中 Dose-Resp 模型拟合，图 3(a)的拟合方程为相关系数R2=0.9949。根据拟合曲线，计算得出 ZnSO4的 EC50=1.23 mg/L，标准偏差为 0.02 mg/L，95%置信区间为1.17～1.29 mg/L。图 3(b)用 Logistic 模型进行拟合，方程为根据拟合曲线和SPSS 软件，可计算出 ZnCl2的 EC50= （0.97±0.02）mg/L，95%置信区间为 0.92～1.03 mg/L，相关系数为0.9982。因此，对发光细菌的毒性大小为：ZnCl2的毒性＞ZnSO4的毒性。通过毒性测试结果可以看出，ZnSO4的毒性小于 ZnCl2的毒性。结合形态分布和存放稳定性结果，选用 ZnSO4作为参比物质。

图3 ZnSO4 比 ZnCl2 的剂量效应曲线Fig.3 The dose-response curves of zinc sulfate and zinc chloride

2.4 参比物质调控菌密度的有效性

菌密度会影响毒性测试的相对发光强度，从而影响测试的灵敏度及准确性[10]。因此，选取毒性参比物是很有必要的。参比物质 1.23 mg/L ZnSO4和 0.1 mg/L 的 HgCl2与菌密度的关系如图 4 可以看出，过高或过低的菌密度都不利于毒性测试。根据标准，EC50值浓度的参比物质相对发光强度在 40%～60%时，测试结果有效。0.1 mg/L 的氯化汞的有效性在菌密度 0.73～0.98 范围内，而 1.23 mg/L ZnSO4的有效性为菌密度 0.86～1.04。

图4 参比物质与菌密度的关系Fig.4 Relationship between reference substance and bacterial density

2.5 鞣制皮坯的生态安全性测试

选取铬鞣革、甲醛鞣革、两性鞣剂 T 鞣革和有机膦鞣革，采用 1.23 mg/L ZnSO4作为参比物质确定测试菌密度，按照 1.2.5 方法，用发光细菌评价这 4种鞣制坯革浸出液的生态毒性，结果见图 5。由图 5可知，随着鞣制坯革浸出液浓度的增加，明亮发光杆菌的相对发光强度减少，其毒性增强。采用 Logistic 函数对铬鞣浸出液和甲醛鞣革浸出液测试数据 进 行 拟 合 ， 拟 合 方 程 为 ：y =-25.82+，相关系数为 0.9948，计算得出铬鞣浸出液的 EC50体积分数为 42.61%，即 21 305 mg/L。对甲醛鞣革浸出液的数据拟 合 方 程 为 ：y =7.17+甲醛鞣革浸出液的 EC50体积分数为 50.57%，即 25，相关系数为 0.9912。而有机膦鞣革浸出液的毒性较低，浸出液的体积分数为 100%时，对发光细菌的相对发光强度仍然有 60%，因此无法计算出其 EC50值。所以鞣制皮坯浸出液对发光细菌的 毒 性 大 小 为 ： 铬 鞣 ＞ 甲 醛 鞣 ＞ 两 性 鞣 剂 T 鞣革＞＞有机膦鞣革。西班牙 833/1988 号法令以明亮发光杆菌为受试生物，当固废浸出液 EC50低于 3000 mg/L，即判定为危险废弃物[21]，而本文所测定的 EC50值均远远大于其阈值，表明现有常用鞣剂鞣制皮坯的废弃物不能视为危废，具有基本的生态安全性。825 mg/L。两性鞣剂 T 鞣革浸出液采用 Dose-Resp 拟合计算得出 EC50体积分数为 67.4%，即 33 700 mg/L，拟 合 方 程 为 y = 0.39 +

图5 鞣制皮坯对发光细菌的剂量效应曲线Fig.5 Concentration-response curve of crust leathers

3 结论

本文比较了 ZnSO4比 ZnCl2的形态分布、存放稳定性以及毒性，结果表明硫酸锌在 pH1～8 范围内形态成分单一、组成恒定，存放稳定性好，并且毒性较小，可以作为参比物质。采用其为参比物质，对常用的鞣制坯革浸出液进行了生态性评价，其毒性大小为：铬鞣革＞甲醛鞣革＞两性鞣剂 T 鞣革＞＞有机膦鞣革，铬鞣剂较其他有机鞣剂更影响皮坯的生态安全性。