刘少静，沈晶晶，卢 颖,2，王娜娜,2，张怡心,2，张德柱，秦 蓓,2**

(1.西安医学院 药学院，陕西 西安710021；2.成都医学院 药学院，四川 成都 610500；3.陕西盘龙药业集团股份有限公司，陕西 西安 710025)

石榴(PunicagranatumL.)属石榴科(Punicaceae)石榴属(PunicaL.)植物，具有悠久的栽培历史和丰富的资源[1-2]。西安临潼是中国石榴的主要产地，截至2017年，临潼区石榴的栽植面积达到8 500 hm2，产量约10万t[3-5]。石榴具有极高的营养价值及医用保健功能，可治久泻、久痢、脱肛、带下、虫积腹痛、疥癣、中耳炎、创伤性出血等症[6-7]。在中国古代的《名医别录》、《本草纲目》、《滇南本草》、《南宁市药物志》等药典中均有关于石榴药用的记载。文献资料表明石榴化学成分以酚类物质、类黄酮物质、鞣花单宁等为主；具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、降血糖、增强免疫力等广泛药理活性[8-10]。其中没食子酸(GA)是石榴中主要的酚类物质之一，是可水解鞣质的组成部分，具有较强的抗氧化作用[11]。

绿原酸(CA)、丹皮酚(Pae)均为经典的酚类化合物，能够有效清除自由基，具备抗氧化、抗衰老等生理活性[12-13]。近年对国内国际功能因子尤其是天然功能因子的关注中，2种以上主要功能因子直接协同增效的复配形式已成为研究的主流。研究证明，多种抗氧化功效因子联合使用比单一组分具有更好的抗氧化效果[14]。作者分析了Pae、CA、GA的协同抗氧化作用，为酚类物质复配抗氧化剂开发提供理论参考。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

Pae、CA、GA：纯度≥98%，中国药品生物制品检定研究院；抗坏血酸(Vc)、二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS+·)：阿拉丁试剂(上海)有限公司；无水乙醇等其他试剂均为分析纯，市售。

分析天平：AX224ZH，奥豪斯仪器(常州)有限公司；自动全波长酶标仪：Multiskan FC，涡旋振荡器：Maxi Mix Ⅱ，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；电热恒温水浴锅：DZKW-D-2，北京市永光明医疗仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的制备

(1)复配样品的制备。按照质量比1∶1分别配置复配产品Pae-CA、Pae-GA、CA-GA；按照质量比1∶1∶1配置复配产品Pae-CA-GA。

(2)样品溶液的制备。称取Pae、CA、GA、Vc及复配产品各约10 mg，置于相应容量瓶中，分别用无水乙醇溶解并定容至刻度，制得质量浓度为100 μg/mL的母液。采用无水乙醇稀释成系列质量浓度(100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL)，t=4 ℃冷藏，备用。

1.2.2 DPPH·清除能力测定

将100 μL不同质量浓度受试物与100 μL DPPH·溶液充分混合，室温避光反应30 min，于波长517 nm处测定吸光度，作为系列样品溶液反应后Ar；以无水乙醇代替DPPH·溶液进行反应，于波长517 nm处测定样品底液吸光度Ax；以无水乙醇代替样品溶液，于波长517 nm测定吸光度，得到空白对照(Ac)。DPPH·的清除率见公式(1)。依据系列质量浓度样品溶液清除率，绘制ρ(样品溶液)-DPHH·清除率曲线，计算半数清除率IC50值。

(1)

1.2.3 ABTS+·清除能力测量

配置ABTS+·溶液，将50 μL不同质量浓度受试物与150 μL ABTS+·溶液混匀，室温下避光反应30 min，于波长734 nm处测定吸光度，作为系列样品溶液反应后Ar；以无水乙醇代替ABTS+·溶液进行反应，于波长734 nm处测定样品底液吸光度Ax；以无水乙醇代替样品溶液，于波长734 nm处测定吸光度，得到空白对照(Ac)。样品溶液对ABTS+·的清除率见公式(2)。依据系列质量浓度样品溶液清除率，绘制ρ(样品溶液)-ABTS+·清除率曲线，计算半数清除率IC50值。

(2)

2 结果与分析

2.1 Pae、CA、GA的自由基清除特性

各受试物DPPH·及ABTS+·清除特性见图1与图2。

ρ/(μg·mL-1)

ρ/(μg·mL-1)

由图1可知，Pae、CA、GA均对DPPH·有一定的清除作用，且清除能力随着ρ(受试物)增加而逐渐升高，但达到一定质量浓度后，部分样品清除DPPH·的能力增长缓慢。ρ(受试物)=50 μg/mL，CA、GA及Vc的清除率趋于平衡。其中GA清除DPPH·的能力在一定质量浓度范围内(3.125～12.5 μg/mL)高于阳性对照Vc。根据曲线拟合结果，Pae、CA、GA及Vc的IC50值分别为>100、10.20、3.02、5.45 μg/mL。清除能力依次为GA>Vc>CA>Pae。

由图2可知，Pae、CA、GA均对ABTS+·有一定的清除作用，随着ρ(受试物)增加，自由基清除率也逐渐升高，在一定质量浓度范围内呈现出一定的量效关系。达到一定质量浓度后，部分样品清除能力趋于平衡。ρ(受试物)=25 μg/mL，GA及Vc的清除率不再升高。GA清除ABTS+·能力在一定质量浓度范围内(3.125～12.5 μg/mL)高于阳性对照Vc。根据曲线拟合结果，Pae、CA、GA及Vc的IC50值分别为>50、24.99、4.25、8.90 μg/mL。清除能力依次为GA>Vc>CA>Pae。

2.2 复配物的自由基清除特性

各复配物DPPH·与ABTS+·清除特性见图3、图4。

ρ/(μg·mL-1)

ρ/(μg·mL-1)

由图3可知，复配产品Pae-CA、Pae-GA、CA-GA及Pae-CA-GA均对DPPH·有一定的清除作用，且在一定质量浓度范围内，样品的清除能力随着ρ(受试物)增加而逐渐升高；达到一定质量浓度后，部分样品DPPH·的清除能力趋于稳定。ρ(受试物)=25 μg/mL，Pae-GA、CA-GA、Pae-CA-GA及Vc的清除率几乎不再变化。根据曲线拟合结果，Pae-CA、Pae-GA、CA-GA、Pae-CA-GA及Vc的IC50值分别为32.60、5.06、2.98、6.03、5.74 μg/mL。清除能力依次为CA-GA>Pae-GA>Vc>Pae-CA-GA>Pae-CA。

由图4可知，复配产品Pae-CA、Pae-GA、CA-GA及Pae-CA-GA均对ABTS+·有一定的清除作用，随着ρ(受试物)增加，自由基清除率也逐渐升高，在一定质量浓度范围内呈现出一定的量效关系。达到一定质量浓度后，部分样品清除能力趋于平衡。ρ(受试物)=25 μg/mL，Pae-GA、CA-GA、Pae-CA-GA及Vc的清除率不再升高。根据曲线拟合结果，Pae-GA、CA-GA、Pae-CA-GA及Vc的IC50值分别为>50、8.01、4.49、9.60、8.19 μg/mL。清除能力依次为CA-GA>Pae-GA>Pae-CA-GA>Pae-CA。

3 结 论

Pae、CA、GA在DPPH·、ABTS+·模型中均表现出一定的抗氧化能力，依次为GA>CA>Pae。将三者按照一定比例进行复配，得到4种复配产品，经DPPH·、ABTS+·模型分析，4种产品均具有良好的抗氧化能力，依次为CA-GA>Pae-GA>Pae-CA-GA>Pae-CA。研究表明Pae、CA、GA具有一定的协同抗氧化作用，这将为酚类物质复配抗氧化剂开发提供理论参考。