胡相卡，刘作栋，赵苗鑫，董苏敏，杨鹤，刘晓娟，马悦，代春美

(锦州医科大学，辽宁 锦州 121001)

糖尿病是一种以血糖高为特点的复杂的代谢紊乱性疾病，据估计，在20～79岁的成年人中，2019年有420万人死于糖尿病，约占全球死亡人数的11.3%[1]。随着人们生活方式、饮食结构的变化以及人口老龄化的加剧，糖尿病的发生率、致残率及致死率有逐年升高的趋势，常涉及各种与微血管和大血管有关的并发症[2]。糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最严重的微血管并发症之一，是终末期肾病(end-stage renal disease，ESRD)和肾功能衰竭的重要原因[3]。DN的病理改变涉及多个方面，包括严重白蛋白尿、肾小球基底膜增厚、肾小球及肾小管肥大、肾小球硬化、肾小管间质纤维化等[4]。越来越多的流行病学和临床前证据表明炎症反应与DN的发生和进展密切相关[5]，炎症反应的激活被认为是肾小球系膜病变的特征，在DN的发病机制中起着重要作用，如趋化因子、细胞因子和粘附因子等促炎因子，它们在DN中过度表达[6-7]。肾小球系膜细胞分泌的转化生长因子β1蛋白(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)在DN病变发生中作为一种纤维化因子起着重要的作用[8]。因此，了解炎症反应和致纤维化因子在DN进展中的机制将有助于识别新的潜在靶点，并有助于创新治疗DN策略的设计。

目前，血糖控制和肾素-血管紧张素系统抑制剂的药物治疗不能有效阻止DN的进展[9]。越来越多的证据表明，中药治疗DN可改善高血糖和蛋白尿，阻断ESRD进展[9]。因此，探寻适合于DN患者终身服用的中药，具有重要意义和研究价值。

表没食子儿茶素没食子酸酯((-)-Epigallocatechin gallate，EGCG)广泛存在于绿茶、五倍子、没食子、柯子等药用植物中，是绿茶儿茶素化合物中含量最多、生物活性最强的化合物之一[10]。以往的研究表明EGCG对DN小鼠和大鼠有保护作用，但其作用机制主要集中在抗氧化应激上[10-13]。本研究主要从抑制致纤维化因子及炎症反应两方面来探讨EGCG对糖尿病大鼠肾脏的保护作用，为中药治疗糖尿病肾病的临床开发应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药物

EGCG购买于宁波禾普生物科技有限公司(批号：20160608)，纯度 ≥ 95%，其结构见图1。其高效液相色谱图由厂家提供，见图2。

图1 EGCG的化学结构

图2 EGCG的高效液相色谱图

1.2 动物

雄性SD大鼠30只，体重(267±17)g，由辽宁长生生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(辽)2017-0801。经锦州医科大学实验动物伦理委员会批准，伦理审查编号为2016013，自觉遵守实验动物福利伦理原则，在锦州医科大学动物实验中心，分笼饲养，室温20 ℃～26 ℃，相对湿度40%～60%，12 h光照周期，自由饮水。

1.3 试剂

链脲佐菌素(Streptozocin，STZ，CAS：1888-3-664，美国，Sigma)；转化生长因子β1蛋白(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)抗体购买于南京建成生物工程研究所；葡萄糖试剂盒、甘油三酯(Triglyceride，TG)试剂盒、胆固醇(Cholesterol，CHO)试剂盒、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)试剂盒、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)试剂盒购买于南京建成生物工程研究所；细胞间粘附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)抗体、血管粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)抗体购买于Abcam。

1.4 仪器

德国 Leica RM2235 型石蜡切片机；BIO-RAD 680型全自动酶标仪；80-2离心机；XD-101倒置显微镜；奥林巴斯AU5400全自动生化分析仪。

1.5 方法

1.5.1 实验动物分组及给药[14]

30只SD雄性大鼠适应性喂养7 d后，随机抽取6只大鼠为正常对照组(Control)。其余24只大鼠一次性腹腔注射柠檬酸缓冲液(0.1 mol·L-1，pH 4.5)新鲜配置的STZ(65 mg·kg-1)溶液，正常对照组大鼠腹腔注射等量的柠檬酸缓冲液。7 d后测得空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)值 ≥ 16.7 mmol·L-1的大鼠为糖尿病大鼠模型。将造模成功的24只大鼠随机分为模型组(DM)、EGCG 10 mg·kg-1·d-1(EL)、20 mg·kg-1·d-1(EM)和40 mg·kg-1·d-1(EH)剂量组，每组6只，EGCG各给药组大鼠按照上述剂量给药，模型组和对照组大鼠给予三蒸水，各组大鼠给药体积均为10 mL·kg-1·d-1。所有动物自由进食、饮水。

1.5.2 标本收集与处理

给予EGCG治疗后于第0周、第6周、第12周，记录各组大鼠的摄食量、饮水量及体重。EGCG治疗12周后，收集各组大鼠24 h 尿液，测尿蛋白；乙醚吸入麻醉后，进行眼静脉取血，离心(4 ℃，3 500 r·min-1，10 min)，收集上清液，按照葡萄糖试剂盒、TG试剂盒、CHO试剂盒说明书分别检测大鼠血清中FBG、TG、CHO水平，全自动生化分析仪检测大鼠血清中血肌酐(Serum creatinine，Scr)、尿素氮(BUN)，按照IL-6试剂盒说明书、TNF-α试剂盒说明书采用ELISA法分别检测大鼠血清中IL-6、TNF-α水平；所有大鼠在麻醉下处死，迅速取出肾脏，称取双侧肾脏重量，计算肾脏指数，一侧肾脏保存于-80 ℃冰箱，另一侧肾置于4%多聚甲醛溶液中固定。

肾脏指数/g·kg-1= 两肾质量(g)/体重(kg)。

1.5.3 肾组织病理形态学观察[7]

甲醛固定组织后脱水浸蜡，石蜡包埋，5 μm厚连续切片，HE染色，光学显微镜下观察各组大鼠肾脏组织形态变化。

1.5.4 免疫组织化学

石蜡组织切片，经过二甲苯、不同梯度的酒精脱蜡后，用0.1 mmol·L-1枸橼酸缓冲液(pH 4.4)140 ℃进行抗原修复2 min，再自然冷却到室温。用PBS缓冲液洗涤，用新鲜配制的3% H2O2在室温下处理15 min，PBS洗涤，滴加10%的正常山羊血清封闭液，滴加TGF-β1(1∶500)、ICAM-1(1∶500)、VCAM-1(1∶500)抗体，在4 ℃冰箱中过夜。PBS洗涤，滴生物素标记的二抗，DAB显色，苏木素复染，脱水透明，封片。用已知阳性切片在同一条件下染色作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。每张切片在200倍视野下随机挑选6个部位拍照，以棕黄色作为判断阳性表达的标准，并应用image J软件分析同视野下阳性细胞与总细胞数的比值作为TGF-β1、ICAM-1和VCAM-1蛋白表达阳性率。

1.5.5 统计学分析

2 结果

2.1 EGCG对STZ诱导的糖尿病大鼠体重、饮水量和摄食量的影响

如图3所示，与正常对照组大鼠相比，模型组大鼠在造模成功后第6周和第12周体重下降(P< 0.01)、饮水量增加(P< 0.01)、摄食量增加(P< 0.05)。与模型组大鼠相比，给予大鼠EGCG后6周，EGCG各给药组体重增加(P< 0.01)，饮水量下降(P< 0.01)；给予EGCG后12周，EGCG 10、20 mg·kg-1·d-1剂量组大鼠饮水量低于模型组(P< 0.01)，EGCG 40 mg·kg-1·d-1剂量组大鼠体重高于模型组(P< 0.01)，饮水量、摄食量低于模型组(P< 0.01)，以上结果说明了EGCG可以改善糖尿病大鼠的体重、饮水量和摄食量等一般体征。

A、B、C：大鼠的体重(A)、饮水量(B)和摄食量(C)；Control：正常对照，DM：糖尿病模型，EL：EGCG 10 mg·kg-1·d-1，EM：EGCG 20 mg·kg-1·d-1，EH：EGCG 40 mg·kg-1·d-1；与正常组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与模型组比较，#P < 0.05，##P < 0.01。图3 EGCG对STZ诱导的糖尿病大鼠体重、饮水量和摄食量的影响

2.2 EGCG对STZ诱导的糖尿病大鼠血清中FBG、TG和CHO水平的影响

与正常对照组大鼠相比，模型组大鼠血清中FBG、TG和CHO水平在造模成功后第12周后升高(P< 0.01)。

与模型组大鼠相比，EGCG治疗12周后，EGCG各给药组大鼠血清中FBG、TG和CHO水平降低(P< 0.01)，说明了EGCG能够使糖尿病大鼠血清中FBG、TG和CHO的水平向正常水平恢复(图4)。

A、B、C：大鼠的FBG(A)、TG(B)和CHO(C)；Control：正常对照，DM：糖尿病模型，EL：EGCG 10 mg·kg-1·d-1，EM：EGCG 20 mg·kg-1·d-1，EH：EGCG 40 mg·kg-1·d-1；与正常组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与模型组比较，#P < 0.05，##P < 0.01。图4 EGCG对STZ诱导的糖尿病大鼠FBG、TG和CHO的影响

2.3 EGCG对STZ诱导的糖尿病大鼠肾重和肾脏指数的影响

如图5所示，与正常对照组大鼠相比，模型组大鼠肾重和肾脏指数增加(P< 0.01)。与模型组大鼠相比，给予糖尿病大鼠EGCG 12周后，EGCG各给药组大鼠肾重和肾脏指数下降(P< 0.01)。

A、B：大鼠的肾重(A)和肾指数(B)；Control：正常对照，DM：糖尿病模型，EL：EGCG 10 mg·kg-1·d-1，EM：EGCG 20 mg·kg-1·d-1，EH：EGCG 40 mg·kg-1·d-1；与正常组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与模型组比较，#P < 0.05，##P < 0.01。图5 EGCG对STZ诱导的糖尿病大鼠肾重和肾指数的影响

2.4 EGCG对STZ诱导的糖尿病大鼠24 h尿蛋白、Scr和BUN的影响

如图6所示，与正常对照组大鼠相比，模型组大鼠24 h尿蛋白增加(P< 0.01)，血清中Scr和BUN增加(P< 0.01)。与模型组大鼠相比，给予糖尿病大鼠EGCG 12周后，EGCG各给药组大鼠24 h尿蛋白和血清中BUN下降(P< 0.05)，EGCG 20、40 mg·kg-1·d-1剂量组大鼠血清中Scr下降(P< 0.01)，说明了EGCG对糖尿病大鼠肾功能具有改善作用。

2.5 EGCG对STZ诱导的糖尿病大鼠肾组织形态的影响

与正常对照组相比，模型组大鼠肾小管上皮细胞肿胀，在胞浆内出现边界清晰的巨大空泡，为空泡样病变，给予EGCG 12周后，EGCG 10、20 mg·kg-1·d-1剂量组大鼠肾小管上皮细胞空泡样病变有所改善，EGCG 40 mg·kg-1·d-1剂量组大鼠肾小管上皮细胞空泡样病变明显得到改善，几乎看不到肾小管上皮细胞空泡样病变发生，说明了EGCG 能够改善糖尿病大鼠肾小管上皮细胞空泡样病变(图7)。

A、B、C：大鼠的24 h尿蛋白(A)、Scr(B)和BUN(C)；Control：正常对照，DM：糖尿病模型，EL：EGCG 10 mg·kg-1·d-1，EM：EGCG 20 mg·kg-1·d-1，EH：EGCG 40 mg·kg-1·d-1；与正常组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与模型组比较，#P < 0.05，##P < 0.01。图6 EGCG对STZ诱导的糖尿病大鼠24 h尿蛋白、Scr和BUN的影响

I：正常对照；II：糖尿病模型；III：EGCG 10 mg·kg-1·d-1；IV：EGCG 20 mg·kg-1·d-1；V：EGCG 40 mg·kg-1·d-1。图7 EGCG对STZ诱导的糖尿病大鼠肾组织形态的影响(HE染色，×200)

2.6 EGCG对STZ诱导的糖尿病大鼠血清中IL-6和TNF-α的影响

如图8所示，与正常对照组大鼠相比，模型组大鼠血清中IL-6和TNF-α水平升高(P< 0.01)，与模型组大鼠相比，给予糖尿病大鼠EGCG 12周后，EGCG各给药组大鼠血清中IL-6和TNF-α水平降低(P< 0.05)，说明了EGCG可降低糖尿病大鼠血清中促炎因子IL-6和TNF-α的水平。

A、B：大鼠血清中的IL-6(A)和TNF-α(B)；Control：正常对照，DM：糖尿病模型，EL：EGCG 10 mg·kg-1·d-1，EM：EGCG 20 mg·kg-1·d-1，EH：EGCG 40 mg·kg-1·d-1；与正常组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与模型组比较，#P < 0.05，##P < 0.01。图8 EGCG对STZ诱导的糖尿病大鼠血清中的IL-6和TNF-α的影响

2.7 EGCG对STZ诱导糖尿病大鼠肾组织中TGF-β1、ICAM-1、VCAM-1蛋白表达影响

与对照组相比，模型组肾组织中TGF-β1、ICAM-1、VCAM-1蛋白表达增加(P< 0.01)(图9、图10)。给予EGCG 12周后，与模型组相比，EGCG各给药组肾组织中TGF-β1、ICAM-1蛋白表达下降(P< 0.01)，说明了EGCG可下调糖尿病大鼠肾组织中致纤维因子TGF-β1和粘附因子ICAM-1的表达。

I：正常对照；II：糖尿病模型；III：EGCG 10 mg·kg-1·d-1；IV：EGCG 20 mg·kg-1·d-1；V：EGCG 40 mg·kg-1·d-1。图9 各组大鼠肾组织中TGF-β1、ICAM-1和 VCAM-1蛋白的表达情况(免疫组织化学染色，×200)

A、B、C：大鼠肾组织中TGF-β1(A)、ICAM-1(B)和 VCAM-1(C)蛋白的表达情况；Control：正常对照，DM：糖尿病模型，EL：EGCG 10 mg·kg-1·d-1，EM：EGCG 20 mg·kg-1·d-1，EH：EGCG 40 mg·kg-1·d-1；与正常组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与模型组比较，#P < 0.05，##P < 0.01。图10 EGCG对STZ诱导的糖尿病大鼠肾组织中TGF-β1、ICAM-1和 VCAM-1蛋白表达的影响

3 讨论

DN是糖尿病的一种严重并发症，饮食习惯在决定糖尿病相关疾病的发生和进展中起着重要作用，适当的饮食(富含水果和蔬菜)可以延迟或预防糖尿病发病过程，多酚和富含多酚食物摄入量的增加与糖尿病发病率及其相关并发症的降低有关[15]。EGCG是绿茶中主要的多酚成分，本实验结果显示，给予EGCG 12周后，糖尿病大鼠体重增加，摄食量、饮水量下降，24 h尿蛋白减少，血清中FBG、TG、CHO、Scr、BUN水平下降，肾小管上皮细胞空泡样病变得到改善，说明了EGCG对糖尿病大鼠的一般体征、血糖、血脂、胆固醇水平及肾功能具有改善作用。

DN发病机制复杂，氧化应激、慢性炎症、间质纤维化等对DN的发展都有很大的促进作用。因此，抑制氧化应激、慢性炎症、间质纤维化是防治DN的一个重要策略。研究发现EGCG可抑制DN大鼠的高血糖、蛋白尿和脂质过氧化，降低肾脏晚期糖基化终末产物的积累及其在肾皮质中相关蛋白的表达，改善相关病理状况、肾损伤和糖毒性，从而减轻因糖代谢相关氧化应激异常引起的肾损伤[13]。EGCG通过在多个阶段激活核因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid2-related factor 2，Nrf2)/抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)信号通路，下调KELCH样ECH关联蛋白1(Recombinant Kelch Like ECH Associated Protein 1，Keap1)、破坏Nrf2-Keap1相互作用来提高Nrf2的核水平缓解DN的进展[10,12]。EGCG通过激活二酰基甘油激酶α(diacylglycerol kinase α，DGKα)改善DN小鼠蛋白尿等肾脏病理变化[11]。这些研究表明EGCG主要通过抗氧化应激来抑制DN的进展，可能与其结构中的没食子酸酯部分和4'-OH密切相关[16]。研究表明EGCG能使异位气管移植闭塞性细支气管炎小鼠的中性粒细胞和巨噬细胞浸润明显减少、参与中性粒细胞募集的炎症细胞因子TNF-α和促纤维化细胞因子TGF-β1降低[17]，抑制脂多糖刺激的小鼠血清中炎症细胞因子TNF-α和IL-6的释放[18]，下调脂多糖诱导人主动脉内皮细胞中ICAM-1的表达[19]以及尿酸诱导的人脐静脉内皮细胞中ICAM-1和TNF-α mRNA的表达[20]，表明了EGCG的抗炎和抗纤维化作用，可能与其结构中的烯酮密切相关[21]。然而EGCG是否通过抑制炎症反应和致纤维化因子来缓解DN的进展，目前还不清楚。本实验主要针对纤维化及炎症两方面进行了研究。

致纤维化因子TGF-β1通过多种分子介质和细胞内信号通路在DN的发展过程中起着核心作用[8]。血糖水平的升高可通过多种机制使TGF-β1的转录和翻译上调，异常细胞内信号传导和代谢、氧化应激和非酶糖基化增加等是TGF-β1在糖尿病病情中上调的关键途径[14]。因此，抑制TGF-β1蛋白的表达也是治疗DN的一种有效手段。本实验结果显示，EGCG可降低糖尿病大鼠肾组织中TGF-β1蛋白的表达量，说明了EGCG可能是通过抑制致纤维化因子TGF-β1来改善糖尿病大鼠肾脏损伤。

研究表明DN是一种炎症性疾病，促炎细胞因子、趋化因子和粘附因子可能与糖尿病肾脏病变中的局部损伤有关，在DN的发病机制中起着重要作用，如促炎因子TNF-α、IL-6及粘附因子ICAM-1和VCAM-1，在DN中过度表达[22-23]。TNF-α是炎症反应的中心介质，在高血糖引起的肾损伤中起重要作用，IL-6是一种重要的炎性细胞因子，在DN大鼠肾脏中显著升高[24]。细胞粘附因子VCAM-1和ICAM-1在DN中表达增加，而且在DN炎症反应中起着重要作用，已引起越来越多的关注，有研究还报道ICAM-1和VCAM-1的表达水平随DN中促炎因子的增加而增加[25-26]。因此，关注炎症反应对抑制DN的发展具有重要意义。本实验结果显示EGCG可使糖尿病大鼠血清中TNF-α和IL-6水平降低，肾组织中ICAM-1的蛋白表达量降低，但对VCAM-1的蛋白表达影响不大，有待进一步研究，说明了EGCG可能是通过抑制促炎因子TNF-α、IL-6及粘附因子ICAM-1来改善糖尿病大鼠肾脏损伤。

综上，本实验结果表明EGCG对糖尿病大鼠肾脏具有保护作用，其机制可能与抑制致纤维化因子TGF-β1、促炎因子TNF-α和IL-6及粘附因子ICAM-1有关，为中药治疗糖尿病肾病的临床应用开发提供依据。