王杰，刘健，文建庭，王馨

安徽中医药大学第一附属医院 安徽合肥 230031

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以对称性多关节炎为主要临床表现的自身免疫性疾病[1]，以关节滑膜慢性炎症、关节的进行性破坏为特征，最终影响患者生活质量和社会功能[2-3]。滑膜成纤维细胞（fibroblast-like synoviocytes，FLS）是RA病理变化过程中的关键效应细胞，伴随FLS大量的增殖、凋亡不足、炎性细胞的大量浸润，出现骨破坏，最终导致关节畸形、功能障碍[4]。同时circRNAs是一类新型的RNA，可作为RA临床血标本的生物标志物。在RA骨破坏的发展中发挥着独特的作用，在FLS、成骨细胞与破骨细胞分化、分子信号通路、免疫炎症反应等方面具有调控作用[5]。本团队前期通过高通量测序及GO分析研究，认为circRNA0003353是参与RA炎症反应的关键circRNA[6]。

湿热痹阻证是RA主要证型之一，主要临床表现为关节肿痛而热，屈伸不利；发热、口渴、不欲饮、烦闷不安、小便黄；舌质红，苔黄腻；脉滑数或弦滑等[7]。导师刘健教授依据新安医学从脾治痹的观点创制具有清热祛湿、健脾通络中药复方新风胶囊（Xinfeng capsule，XFC，由黄芪、薏苡仁、蜈蚣、雷公 藤组成，专利号：ZL201310011369.8）、黄芩清热除痹胶囊（Huangqin Qingre Chubi capsule， HQC，由黄芩、栀子、薏苡仁、威灵仙等组成，专利号：ZL201110095718.X）治疗RA湿热痹阻证疗效明显，可以显著降低免疫炎症指标如红细胞沉降率（ESR）、超敏C-反应蛋白（hs-CRP）、类风湿因子（RF）、抗环瓜氨酸肽抗体（CCP-AB）、免疫球蛋白G（IgG）、补体C3等[8-9]。但是RA湿热痹阻证circRNA0003353表达如何，炎症、骨代谢指标表达如何，以及XFC联合HQC能否改善circRNA0003353及免疫炎症、骨代谢指标尚不明确。

回顾性数据挖掘一般是指从过往大量的数据中搜索隐藏于其中的有着特殊关系性（属于Association rule learning）的信息的过程。主要有关联分析、聚类分析、分类分析、异常分析、特异群组分析和演变分析等[10]。本文拟采用回顾性数据挖掘之关联规则分析，观察RA湿热痹阻证患者circRNA0003353及炎症、骨代谢指标的变化，研究健脾清热通络法XFC联合HQC干预后对其的影响，为临床应用提供借鉴。

材料与方法

1 临床病例来源

收集安徽中医药大学第一附属医院风湿免疫科住院RA湿热痹阻证患者（2021年4月—2021年8月）30例，25例正常人来自我院健康体检中心。用肝素钠抗凝管清晨空腹留取静脉血4mL，利用Ficoll提取PBMCs，保存至-80℃冰箱备用。

2 诊断及纳排标准

2.1 诊断标准 所有患者均符合2010年美国风湿病学会（ACR）联合欧洲抗风湿病联盟（EULAR）提出的RA诊断标准[11]；RA湿热痹阻证中医辨证论治方案参照2018年类风湿关节炎病证结合诊疗指南[7]。

2.2 纳入标准 符合上述中西医诊断；均签署知情同意书；治疗前后实验室指标完善；住院期间均给予中医药治疗：XFC（由黄芪、薏苡仁、蜈蚣、雷公藤组成）每粒含生药0.4 g，专利号：ZL201310011369.8；HQC（由黄芩、栀子、薏苡仁、威灵仙等组成）每粒含生药0.4 g，专利号：ZL201110095718.X；再加中医辨证论治[7]1剂/d，均以四周为一疗程。治疗药物由安徽中医药大学第一附属医院中药房和制剂室提供。

2.3 排除标准 关节严重畸形，完全丧失关节功能者；合并有心、肝、肾等严重疾病以及严重关节外表现；妊娠或哺乳期妇女；肿瘤性疾病；观察期间应用免疫抑制剂和生物制剂的患者。

本研究经安徽中医药大学第一附属医院伦理委员会批准（伦理编号：2019AH-12）。

3 观察指标

一般性指标：年龄、性别、病程；circRNA0003353表达；免疫炎症指标：ESR、CRP、RF、IgA、IgG、IgM、C3、C4；骨代谢指标：BALP、OC、OPG、RANKL。

4 实验试剂及仪器

4.1 DMEM 培养基（Hyclone）；胎牛血清（浙江天杭生物公司）；二甲基亚砜（DMSO，Sigma 公司）；ELISA试剂盒（JYM0155Hu，JYM0082Hu，武汉基因美生物科技公司）；逆转录试剂盒（TaKaRa）；DAPI（Solarbio）；Fluoromount-G荧光封片剂（SourthernBiotech）；山羊抗兔的二抗（Cy3）（红光）（Beyotime，A0516）。

4.2 荧光显微镜（Motic，BA410E）；普通PCR仪（杭州晶格科学仪器有限公司，K960）；荧光定量PCR仪（Thermo Scientific，PIKOREAL 96）；高速台式冷冻离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司，JW-3021HR）；酶标仪（雷杜生命科学股份有限公司，RT-6000）

5 实验方法

5.1 RT-qPCR检测circRNA0003353的表达Trizol提取各组RA-FLS总RNA，逆转录反应，进行扩增反应，琼脂糖凝胶电泳，采用Gelpro32 凝胶图像分析软件对PCR产物进行半定量分析，以β-actin表达量为参照采用2-△△Ct进行相对定量分析。

5.2 ELISA法检测免疫炎症指标ESR、CRP、RF、IgA、IgG、IgM、C3、C4，骨代谢指标BALP、OC、OPG、RANKL的表达 采集RA湿热痹阻证患者组与正常对照组血液，室温下自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。将上清液加入酶标板中（每孔100uL），37℃孵育1.5h，采用ELISA方法，严格按照各试剂盒说明书进行操作，酶标仪测定490 nm处的OD值，以上重复3次。

6 关联规则分析

对circRNA0003353及临床指标以四分位数为界，四分位数内取值定为“T”，四分位数外取值定为“F”，治疗中有XFC联合HQC用药定为“T”仅有XFC或HQC取值定为“F”，设最小支持度设置为35%，最小置信度设置为85%，使用SPSS Clementine 11.1进行分析。其计算公式如下[12]:

7 统计学方法

采用SPSS 23. 0软件进行统计学处理，采用Graphpad 8.0进行图表制作，计量资料满足正态性以表示，采用两独立样本t检验；不满足正态性以四分位数表示，采用秩和检验；多组数据比较采用oneway ANOVA检验，以P＜0.05有统计学意义。

结 果

1 RA湿热痹阻证患者一般资料、circRNA0003353、炎症指标、骨代谢指标变化

在纳入的正常对照组与RA湿热痹阻证患者组病例中，RA湿热痹阻证患者年龄（52.12±11.64）岁，男5例（16.67%），女25例（83.33%），正常人患者年龄（49.66±14.09）岁，男4例（16%），女21例（84%），2组患者在年龄、性别上无显著差异（P＞0.05），具有可比性；与正常对照组相比，RA湿热痹阻证患者circRNA0003353、RANKL、ESR、CRP、RF、CCP-AB、IgA、IgG、IgM、C3和C4指标升高（P＜0.05），OC、BALP、OPG指标降低（P＜0.05）。见表1。

表1 RA湿热痹阻证患者与正常人实验室指标对比

2 circRNA0003353与RA湿热痹阻证患者炎症指标、骨代谢指标之间的相关性分析

Spearman相关性分析结果显示，RA湿热痹阻证患者circRNA0003353表达与ESR、RF、RANKL呈正相关（P＜0.05）。见图1。

图1 circRNA0003353与RA湿热痹阻证患者炎症指标、骨代谢指标之间的相关性分析

3 RA湿热痹阻证治疗前后circRNA0003353、免疫炎症指标和骨代谢指标的变化

健脾清热通络法治疗后，RA湿热痹阻证患者circRNA0003353的表达下降，骨代谢指标OC、OPG、BALP升高，RANKL降低（p＜0.05），免疫炎症指标ESR、CRP、CCP-AB、RF、IgG降低（p＜0.05），见表2。

表2 RA湿热痹阻证治疗前后免疫炎症指标、骨代谢指标及其余各指标的变化

4 XFC联合HQC与实验室指标改善的关联规则分析

关联规则结果显示，XFC+HQC对实验室指标改善的支持度均大于35%、置信度均大于85%、提升度均大于1；支持度最高的前三位分别是XFC+HQC与circRNA0003353（90.00%），XFC+HQC与OPG（90.00%），XFC+HQC与RANKL（90.00%），见图2，表3。

图2 XFC联合HQC与各指标改善的关联规则分析图

表3 XFC联合HQC与各指标改善的关联规则分析

讨 论

中医药治疗RA湿热痹阻证在疗效和安全性上具有显著优势，国医大师范永升先生临证经验认为活动期RA主要以风湿热痹型为主，运用清热祛风通络法治疗RA效果明显，主要使用清热解毒、祛湿通络、活血止痛之类中药[13]。梁国强[14]研究发现相比于西药对照组，吴门三黄汤联合西药组可以有效地降低ESR、C反应蛋白、IL-1等指标。王杰[15]通过数据挖掘和动物实验研究发现XFC联合HQC可以显著降低RA湿热痹阻证患者体内免疫炎症指标，改善AA湿热证大鼠关节炎肿胀程度，抑制IL-1β、IL-6、TNF-α表达，升高IL-10表达。但是采用具有健脾清热通络法XFC和HQC联合应用改善RA湿热痹阻证circRNA、免疫炎症及骨代谢指标鲜见报道，本文研究结果表明与正常对照组相比，RA湿热痹阻证患者体内circRNA0003353高表达，免疫炎症指标ESR、CRP、RF、CCP-AB、IgA、IgG、IgM、C3和C4指标，骨代谢指标RANKL升高，而OC、BALP、OPG指标降低，且circRNA0003353表达与ESR、RF、RANKL呈正相关。XFC联合HQC可以下调circRNA0003353表达，降低炎症指标，改善骨代谢失衡。

具有健脾化湿、清热通络的XFC、HQC是国家发明专利（专利号：ZL201310011369.8；ZL201110095718.X），XFC由黄芪、薏苡仁、蜈蚣、雷公 藤组成，以黄芪、薏苡仁为君药，具有健脾化湿通络作用，其中黄芪甲苷可以通过调控JNK信号通路相关细胞因子表达抑制TNF-α诱导的RA滑膜成纤维细胞增殖[16]。动物实验表明[17]薏苡仁蛋白和薏苡仁挥发油对可以减轻AA大鼠关节红肿的症状，降低关节炎症。HQC由黄芩、栀子、薏苡仁、威灵仙等组成，以黄芩、栀子为君药，其中黄芩素可减轻RA患者外周血单个核细胞炎症反应[18]，栀子苷可升高IL-10表达，降低IL-17[19]。诸药合用，共奏健脾化湿、清热通络之效，从而起到改善免疫炎症和骨代谢的作用。

但是本文对于circRNA0003353是如何调控炎症、骨代谢指标以及XFC联合HQC如何通过调控circRNA0003353改善炎症、骨代谢指标尚未研究。下一步我们将用系统生物学方法，观察circRNA0003353干扰和过表达状态下对下游指标的调控关系，以及XFC联合HQC的干预机制。