王 聪, 沈思平，光善仪，徐洪耀

(1. 东华大学 化学化工与生物工程学院，生态纺织教育部重点实验室,上海 201620;2. 东华大学 分析测试中心与材料学院，纤维改性重点实验室,上海 201620)

0 引 言

谷胱甘肽(GSH)是细胞内一种必需的硫醇，在生理功能、维持细胞内氧化还原活性、异生物质代谢、细胞内信号转导和基因调控中起主要作用[1-2]。细胞内GSH含量异常与多种疾病有关，如癌症、心血管、阿尔茨海默病、衰老、心脏病等疾病[3-5]，特别是癌细胞中GSH的含量明显高于正常细胞[6-7]。因此，开发快速、简单和高选择性的方法来检测 GSH是非常必要的。目前检测GSH的方法主要包括利用高效液相色谱 (HPLC)[8]、伏安法[9-10]、电化学分析[11-12]、傅里叶变换红外光谱 (FTIR)、毛细管电泳 (CE)、质谱和荧光光谱等[13-15]。其中，小分子荧光探针因其灵敏度高，操作简单，稳定性强，重现性好，成像好等特点被广泛应用[16-17]。罗丹明B及其衍生物是以氧杂蒽为母体的碱性呫吨类荧光染料，当它的衍生物螺环打开时会引起荧光“开关”现象，同时伴随荧光颜色变化[18-20]，所以实现对GSH的特异性检测一直是罗丹明类探针研究的热点。

本文以罗丹明B酰肼与3,3′-二硫代二丙酸为原料设计并合成了一种新型的对谷胱甘肽(GSH)具有特异性识别功能的二硫荧光分子RNSS。通过对RNSS进行荧光光谱性能研究，发现当RNSS的乙腈溶液中加入GSH后，在561 nm光激发下其在585 nm处出现很强的粉色荧光，并且其对GSH的荧光响应具有高选择性以及高灵敏性同时还具备较强的抗干扰能力，该研究可为之后对GSH的检测提供新思路。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

仪器：DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器；Nicolet8700型傅里叶变换红外光谱仪；Bruker AMX-600型核磁共振测定仪； LS55型荧光光度仪。

试剂：二氯亚砜，无水乙腈，二氯甲烷，谷胱甘肽均为分析纯；所用原料3,3′-二硫代二丙酸，罗丹明 B和水合肼均为分析纯；罗丹明酰肼为实验室自制；实验室用水均为去离子水。

1.2 探针RNSS的合成

在250 mL三口烧瓶中加入3,3′-二硫代二丙酸(40.0 g, 190.0 mmol,)，在常温下氮气氛围下，缓慢滴加亚硫酰氯(85.0 mL, 1.1 mol)。加热回流反应16 h，最终反应溶液为淡黄色。[21]真空旋转蒸发除去过量的亚硫酰氯，产率98%。1H NMR (600 MHz, 303 K, DMSO): δ 2.62 (t, 7.0 Hz, 4H)，2.87 (t,J=7.0 Hz, 4H) ppm。

准确称取罗丹明酰肼(0.0459 g, 0.1 mmol)和无水K2CO3(0.0138 g, 0.1 mmol)并将其溶解在二氯甲烷(10.0 mL)中，逐滴加入3,3′-二硫代丙酰氯(0.0219 g, 0.1 mmol)的二氯甲烷溶液(5.0 mL),30 ℃在氮气气氛下反应24 h。过滤，将滤液用二氯甲烷与饱和食盐水萃取，并用无水硫酸钠干燥过夜。过滤后减压旋蒸浓缩得到紫色固体。利用柱层析(CH2Cl2∶CH3OH=100∶1)进行纯化，最终得到浅紫色固体(RNSS)，产率为51%。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 9.59 (s, 2H), 7.82 (s, 2H), 7.57 (td,J=7.5, 1.4 Hz, 3H), 7.53 (td,J=7.4, 1.2 Hz, 2H), 7.05～6.98 (m, 2H), 6.46 (d,J=8.5 Hz, 4H), 6.30 (s, 4H), 6.29 (s, 4H), 3.29 (dd,J=7.0, 2.1 Hz, 16H), 2.55 (t,J=7.3 Hz, 4H), 2.31 (t,J=7.4 Hz, 4H), 1.06 (t,J=7.0 Hz, 24H)。

图1 合成路线Fig 1 Synthetic route

2 结果与讨论

2.1 传感材料RNSS的光学性能

图2为RNSS的紫外-可见光谱图。RNSS本身在500 nm之后没有任何吸收，在加入GSH后，在557 nm处呈现一个明显的吸收峰。另外，通过手持紫外灯照射，我们发现加入GSH后，探针RNSS的乙腈/水(1∶1)溶液中有明显的粉色荧光产生，而RNSS本身并无荧光。因此，实验测试了在乙腈/水(1∶1)溶液中，RNSS+GSH的激发和发射光谱。如图3所示，在561 nm处激发时，加入GSH后的RNSS溶液的最大吸收波长为585 nm。因此化合物RNSS可以用作识别GSH的荧光传感材料。

图2 在CH3CN/H2O(v/v=1/1)溶液中，RNSS和RNSS+GSH的紫外-可见吸收光谱Fig 2 UV-vis absorption spectra of RNSS and RNSS+GSH in CH3CN/H2O (v/v=1/1) solution

图3 在CH3CN/H2O(v/v=1/1)溶液中，RNSS+GSH的激发和发射光谱Fig 3 Excitation and emission spectra of complex [RNSS+GSH] in CH3CN/H2O (v/v=1/1) solution

2.2 RNSS荧光传感材料的灵敏性

在CH3CN/H2O(v/v=1∶1)溶液中，激发波长为561 nm的条件下，进行了GSH对探针RNSS的荧光滴定实验。如图4所示，探针RNSS(浓度为1×10-3mol/L)随着GSH(浓度为1×10-3mol/L)的逐渐加入在585 nm处出现荧光发射峰，并且荧光强度逐渐增强。当GSH的加入量达到1.0当量时，增加趋势减缓，之后不再随GSH的加入增加而增加，这表明该探针与GSH是以1∶1进行反应的。

图4 在CH3CN/H2O(v/v=1/1)溶液中加入(0～100 μmol/L)GSH后，探针RNSS的荧光发射光谱图。(内插图为585 nm处体系对应的不同荧光强度点)Fig 4 The fluorescence emission spectrum of the probe RNSS after adding (0-100 μmol/L) GSH to the CH3CN/H2O (v/v=1/1) solution (the inset is the different fluorescence intensity points corresponding to the system at 585 nm)

在滴定曲线实验的基础上，可得到在585 nm处的F/F0与GSH浓度之间的线性回归方程，如图5其线性回归方程为y=0.508x-1.914，线性相关系数R2=0.988，根据DL=3σ/K，其中σ为探针平行测试20次的标准偏差，K为线性回归方程的斜率，可计算出检出限为6.063×10-6mol/L。图6表示相对荧光强度的倒数1/[F-F0]与GSH浓度倒数1/[GSH ]的线性关系曲线,根据 Benesi-Hildebrand[18]方程，通过图中斜率和截距计算得到配位常数为Ka=1.341×104,由此表明探针RNSS与GSH体系可以稳定存在。

图5 相对荧光强度F/F0和GSH浓度的线性关系曲线Fig 5 Linear relationship curve between relative fluorescence intensity F/F0 and concentration of GSH

图6 相对荧光强度的倒数1/[F-F0]和1/[GSH]的线性关系曲线Fig 6 The linear relationship curve between 1/[F-F0]and [1/GSH]

2.3 RNSS荧光传感器对氨基酸选择性和竞争性

之后，在CH3CN/H2O(v/v=1∶1)溶液中，探针浓度保持100μmol/L，分别加入21种常见的氨基酸(100μmol/L)(L-Arg、L-His、L-Ala、L-Gly、Cys、L-Val、L-Pro、L-Leu、L-Phe、L-Ser、L-Met、L-Glu、L-Asp、L-Lys、L-Thr、L-Tyr、GSH、L-Asn、L-Trp、L-lle、L-Gln)，对其荧光光谱性能进行测试。如图7所示，在CH3CN/H2O(v/v=1∶1)溶液中，激发波长为561 nm的条件下，与其他氨基酸相比探针在加入GSH后，其在585 nm处有显著的荧光增强。该荧光光谱实验结果表明探针RNSS是对GSH具有高度选择性的荧光探针。

图7 CH3CN/H2O(v/v=1/1)溶液中加入不同氨基酸(100 μmol/L)时，探针RNSS(100 μmol/L)的荧光发射光谱图Fig 7 Fluorescence emission spectra of probe RNSS (100 μmol/L) with different amino acids (100 μmol/L) added to CH3CN/H2O (v/v=1/1) solution

此外，为了进一步研究其他氨基酸是否对RNSS与GSH配合物的稳定性产生影响，分别在RNSS+GSH配合物溶液中加入其他氨基酸，结果如图8所示。经实验研究发现，当加入其他氨基酸之后，溶液在585 nm处的荧光强度几乎没有变化。因此，配体对GSH的选择性识别具有良好的抗干扰能力，从而可以作为一种选择性识别GSH的荧光探针。

图8 在CH3CN/H2O(v/v=1∶1)溶液中，分别向探针RNSS(100 μmol/L)和探针RNSS(100 μmol/L)+GSH(1 mmol/L)体系中加入不同氨基酸(100 μmol/L)时585 nm处的荧光强度Fig 8 In the CH3CN/H2O (v/v=1∶1) solution, when different amino acids (100 μmol/L) are added to the probe RNSS (100 μmol/L) and probe RNSS (100 μmol/L) + GSH (1 mmol/L) system respectively, at 585 nm Fluorescence intensity

2.4 探针RNSS对GSH的检测机理

为进一步探究探针RNSS与GSH的检测机理，采用Job-plot曲线实验的方法进行研究。固定探针RNSS与GSH的总浓度为200 μmol/L，改变两者之间的比值测定体系的荧光强度。如图9所示，两者之间比例为1∶1时，荧光强度达到最大值。因此可以确定探针RNSS与GSH以1∶1的形式进行反应的。进一步支持了滴定曲线分析的结果。综上所述，可以推断出GSH是以1∶1的方式与探针RNSS发生取代反应，促进螺旋体内酯开环，释放出罗丹明发色团，使荧光颜色由无色变为粉色。开环过程预计是由于先前发现的螺环内酰胺羰基和谷胱甘肽部分的游离氨基之间的氢键作用，如图10所示[22]。

图9 探针RNSS与GSH的Job-plot曲线Fig 9 Job-plot curve of probe RNSS and GSH

3 结 论

设计合成了一种新型的带有二硫键的罗丹明类化合物RNSS，该分子在乙腈溶液中可以作为荧光探针对GSH进行检测。实验结果表明，在探针中加入等量GSH后，在585 nm处出现明显的粉色荧光，并且不会受到其他氨基酸离子的干扰，说明该探针具有较好的灵敏性和高选择性，其检出限可以达到6.063×10-6mol/L。配位常数为Ka=1.341×104，表明探针RNSS与GSH体系可以稳定存在。综上所述，RNSS可作为有效检测GSH的一种光学探针材料。本研究为今后 GSH新型探针分子的研究及其未来生物应用研究提供了重要思路。