杨 哲，陈 凌，王海岗，王瑞云，，乔治军

（1.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801；2.山西农业大学 农业基因资源研究中心/农业农村部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室/杂粮种质资源发掘与遗传改良山西省重点实验室，山西 太原 030031）

糜子（Panicum miliaceumL.）属禾本科黍属[1]1年生禾谷类作物，耐瘠薄、早熟和抗旱，原产于我国，为北方旱地可持续农业主栽作物[2]。糜子作为最古老的作物之一，已有1万年的耕作历史[3]。全世界糜子种植面积约600万hm2，在非洲、亚洲中部、东欧和北美等地都有分布[4]。糜子具有很高的能量和蛋白质，营养丰富，与小麦、玉米和水稻相比，富有大量的铁、钾、镁、钙、锌、磷、多肽类和人体必需氨基酸，同时还是黄酒的制作原料，对糜子研究的深度和广度日益加强[5]。糜子具有丰厚的抗旱基因，运用基因工程手段发掘和克隆其抗旱基因，可用于改进其他农作物的遗传性状。糜子在干旱胁迫下会在形态、生理等方面形成适应机制,抗旱基因在干旱胁迫下表达受阻，复水之后表达量明显提高[5]。糜子富含对健康有益的化合物，如卵磷脂对人体神经系统起保健作用，可以缓解人体衰老，预防老龄化疾病的发生[6]。

全球糜子种质资源有20 000多份，我国目前保存有8 800多份，从分子水平准确评价其遗传多样性，有利于合理开发利用，提高糜子作物的品质，促进育种工作方面的研究[7]。随着种质资源的不断采集与引进，2003年DNA条形码首次提出，对种质资源区别鉴定技术日趋完善，对大量的种质资源数字化和网络化管理及种质间资源的亲缘关系对比更加快捷方便。陈昌文等[8]筛选来自桃8条染色体的16对微卫星引物，最终构建了237份桃品种资源的分子身份证；赵艳杰等[9]利用40对微卫星引物构建了182份东北地区大豆品种的DNA指纹库；高运来等[10]筛选获得9对引物，构建了黑龙江省83份大豆品种的分子身份证；杨阳等[11]用17对微卫星引物构建了36个茶树品种的分子身份证；李红琴等[12]逐级筛选，最终确定23对微卫星引物，构建了青海省66份小麦品种的分子身份证。马琳等[13]通过筛选确定7对微卫星标记，构建了130份甘蓝型油菜品种的分子身份证。

糜子的研究多为糜子育种栽培，基于微卫星标记的分子身份证少有研究。本研究利用微卫星引物筛选技术对21份山西糜子种质资源进行遗传多样性评价，构建糜子种质资源的DNA二维码，利用糜子种质资源的遗传多样性与地理环境分布特征，为优异种质资源鉴定、保护提供技术支撑，为糜子起源演化和传播提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试21份糜子种质资源（表1），来源于山西不同糜子生态栽培区。

表1 21份糜子试验材料Tab.1 21 broomcorn millet materials tested

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取与检测 使用改进的CTAB法提取糜子基因组DNA，检测其纯度、质量和浓度后，稀释10倍。

1.2.2 PCR扩增 采用BIO-GENER基因扩增仪进行扩增，反应体系：1.6μL dNTPs、7.4μL dd H2O、0.8μL引物（最终浓度为0.4μmol/L）、10μL 2×MasterMix和1μL DNA模板。聚合酶链式反应扩增过程为：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，50 s退火，72℃延伸60 s，进行36次循环；72℃延伸10 min。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 聚合酶链反应扩增产物用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，使用浓度0.1%硝酸银银染。

1.3 数据分析

根据对PCR扩增的条带数据进行读取基因组数据，有条带的读取“1”，无条带的读取“0”，并将数据转换成不同格式，以适应不同软件计算试验参数，利用PowerMarker 3.25和MEGA 5.0等软件分别计算引物的PIC及遗传多样性参数。使用东北农业大学分析软件ID Analysis 4.0构建DNA分子身份证。输入相应的字符串并使用网络中的在线条形码生成器（http://barcode.cnaidc.com/app/html/bcgcode128.php）即可生成DNA条形码分子身份证；将糜子种质材料的基本信息与身份证输入在线二维码技术（https://cli.im/）生成DNA二维码分子身份证。

2 结果与分析

2.1 DNA的多态性及遗传参数分析

利用21份糜子资源对四、五、六碱基引物共12对进行筛选，确定多态性高的引物用于分子身份证的构建。表2表明，四碱基重复多态性引物重复系列为：CTAG（6个）、CGAG（5个）、GGCC（5个）、TTGG（6个）、AGGA（6个）、CAGC（6个）、GATG（6个）共7种，其中，CGAG与GGCC最少。五碱基多态性引物碱基重复类型有CCTTT（5个）、ACACC（5个）、CGCGC（5个）、AATAG（5个），一共有4种（各占25%）。六碱基重复基序为TCATCT（6个），只有1种。有3对引物与其他引物相似系数过高，被剔除，剩余9对引物扩增结果清晰、稳定性好的引物，可作为候选核心引物用于构建糜子资源分子身份证。

从表3可以看出，21份材料在9个位点共检测出等位变异27个，每个位点检测到3个；有效等位基因数介于2.541 2~2.995 9，平均为2.841 2；多样性指数介于0.995 8～1.097 9，平均为1.066 1；观测杂合度介于0.529 4~0.888 9，平均为0.705 8；期望杂合度介于0.623 8~0.684 2，平均为0.664 6；Nei's期望杂合度（PIC）介于0.606 5~0.666 2，平均为0.646 9；多态性信息含量介于0.601 0~0.772 0，平均为0.707 6。综上所述，9个引物的PIC值都大于0.5，可用于构建DNA二维码。

表2 多态性微卫星引物碱基重复基序Tab.2 Base repeat motifs of polymorphic microsatellite primers

表3 核苷酸重复性遗传参数Tab.3 Genetic parameters of nucleotide repeatability

2.2 糜子资源DNA条形码与二维码构建

将21份糜子种质的字符串导入到条形码生成器中，得到DNA条形码。将糜子种质的名称、统一编号、来源和身份证号信息输入在线二维码生成器得到DNA二维码（图1）。

3 结论与讨论

3.1 分子标记的选择

随着糜子作物全基因组测序技术的开展，构建覆盖全基因组的高通量、易操作、高精度的DNA分子身份证已成为迫切需要解决的问题。DNA分子标记具有多态性高、重现性好、共显性且覆盖整个基因组等特点[14]。分子标记经历了3个阶段：（1）基于杂交的标记（RFLP）；（2）基于PCR的标记（RAPD、ISSR和微卫星等）；（3）基于单核苷酸的标记（SNP）[15]。近年来，分子辅助标记在物种鉴定上广泛应用。在BMT测试指南草案中，国际植物种类保护联盟把构建DNA指纹数据库的标记确定为微卫星和SNP[15]。苑克俊等[16]利用6个微卫星标记构建杏系的分子身份证，对杏种质的保护提供参考。樊晓静等[17]利用SNP标记建立茶树品种的分子数据库，为茶树品种资源保护鉴定提供思路。本试验基于糜子全基因组测序基础上，分子标记方法同王瑞云等[18]和苑克俊等[16]，利用微卫星标记构建糜子品种资源的DNA二维码。相比较RFLP标记需要同位素标记、一定数量的探针；RAPD等标记对试验条件的严格要求；SNP高额的昂贵的试验器材与试剂费用，微卫星标记只需预先设计引物，且检测效果好，合成成本低。本研究基于9个微卫星标记构建21份糜子资源DNA二维码，有利于品种资源的有效鉴别、区分。

3.2 DNA指纹图谱与分子身份证编码区别

DNA指纹图谱是构建种质资源身份证的基础，分子身份证与DNA图谱功能相同。DNA图谱可以区分作物个体间差异，而分子身份证可以实现DNA指纹数字化，使种质资源的检索容易快捷[19]。与DNA图谱相比较，分子身份证检测更灵敏。目前，用微卫星标记构建分子身份证的编码采用3种措施：（1）根据微卫星指纹图谱，用0和1表示某个等位基因扩增DNA条带的存在有无，并将微卫星指纹图谱转换为由0和1组成的字符串，即种质资源的分子身份证[20]。（2）等位基因赋值编码类型，每对引物扩增的基因从小到大依次编码，当有2个等位基因时，选择碱基数较少的一个[20]。（3）基因型赋值编码类型，将获得的一系列带型用单个数字进行编码，依照固定引物串联各带型编码，形成一组数据，即种质资源的分子身份证[21]。本研究采用的第1类措施编码，该措施统计方便，书写简洁和字符串长短适中且易于检索。

3.3 遗传多样性分析

随着微卫星分子标记的深入研究，其广泛应用为作物的遗传多样性评估提供了重要的分子检测工具。刘笑瑜等[22]利用6对微卫星引物对我国糜子种质遗传多样性进行研究，多样性指数（I）值为0.542 6和PIC值为0.340 3。董俊丽等[23]对国内外的96份糜子资源进行微卫星标记评估，共检测出128个等位基因数，平均每个位点5.82个，I值为0.409 7，PIC值为0.392 0。王瑞云等[18]利用15个特异性微卫星对不同生态区的132份糜子资源进行遗传多样性的评价，共检测到107个等位变异基因，平均各位点7个，I值和PIC值分别为0.529 8和0.486 4；寇淑君等[24]用22对微卫星引物对131份糜子材料进行遗传多样性评价，共检测到128个等位变异基因，平均每个位点5.82个，检测到I值为0.628 4，PIC值为0.587 4。本试验采用微卫星标记进行遗传多样性分析，平均遗传多样性指数和PIC值分别为1.066 1和0.707 6，期望杂合度平均值为0.664 6，观测杂合度平均值为0.705 8，说明糜子遗传多样性较高，均高于以往研究结果[18，22-24]，这与试验材料的来源有关或与高基元引物较低、基元引物检测精度高有关，与试验材料的来源有关。杂合度反映的是群体内遗传变异程度，观测杂合度与陈小红等[25]、王舒婷等[26]观测杂合度相差不大，说明育种后代的亲缘关系密切。等位基因数范围无较大差异，但与王瑞云等[18]、董俊丽等[23]和寇淑君等[24]的观测等位基因数相差较大，说明等位基因数的多少与引物多态性和样品地理位置有关。