慢性心肌缺血除导致急性冠脉综合征外，可继发缺血性心肌病（IHD），引起心肌细胞凋亡、坏死，心肌纤维化重构，严重损害心脏功能，甚至导致死亡。此外，心肌缺血可继发多种心律失常，以心房颤动(AF）最多见。AF可诱发卒中和体循环动脉栓塞，研究表明AF患者缺血性卒中风险是非AF患者的4～5倍。心肌缺血继发AF的具体机制尚不清楚，大量证据提示缺血引起的心肌细胞凋亡在其中扮演重要角色。然而，目前针对细胞凋亡的干预措施效果并不理想，亟待开发新的治疗靶点。

近年来，RNA 在人体生理、病理过程中的重要作用被不断揭示。研究发现，敲低长链非编码RNAZFAS1可以抑制心梗大鼠心肌细胞凋亡。mRNA 降解与线粒体损伤密切相关，是促使细胞凋亡发生的重要病理基础。广泛的mRNA 降解是细胞凋亡早期的标志性特征，它的出现甚至早于膜脂质紊乱、DNA 断裂及翻译起始因子失活。有研究表明，许多编码功能蛋白的mRNA在凋亡的非洲爪蛙卵中明显降解，以管家基因最为显著，更有学者在植物和酵母菌发生凋亡时发现了rRNA和mRNA的裂解。此外，通过CD95等死亡受体诱导小鼠胸腺细胞凋亡后，细胞内包括管家基因在内的大量mRNA发生了降解。但截至目前，凋亡相关mRNA的降解是否影响心肌细胞的凋亡尚不清楚。

中国工程院院士、中冶建筑研究院有限公司董事长越清瑞，株洲市副市长何朝晖，中国工程建设焊接协会常务副会长刘景凤等领导以及来自科研院所、高校的知名教授、学者，工程建设行业施工企业、焊接设备材料制造企业的专家、技术人员等共计220名代表参加了本次会议，《金属加工》杂志作为该活动的支持媒体也应邀出席了本次活动。

多核糖核苷酸核苷转移酶1（PNPT1)是一种高度进化的保守基因，其编码的PNPT1蛋白主要定位于线粒体膜间隙内。功能学研究发现，在HCT 116细胞中线粒体内的PNPT1主要发挥RNA转运功能，而泄露至细胞质后其核酸外切酶活性可诱发mRNA降解，引起细胞凋亡。但是该蛋白对凋亡相关mRNA的调控在缺血性心肌病中是否发挥作用尚未见报道。

本研究通过敲低HL-1心肌细胞的PNPT1基因，以氧糖剥夺（OGD）模拟体内心肌缺血损伤环境，进而探讨抑制PNPT1对OGD诱导的HL-1心肌细胞凋亡的影响及作用机制，以期为IHD治疗的抗细胞凋亡策略提供新的干预靶点。

第一类“根据材料回答”类，我一般会告诉学生答案就来自材料，要求学生分析材料，找出试题设问与材料中一致的内容。如2009年安徽省高考卷第36题第一问：依据材料一指出南宋和清朝前期外贸机构的名称。通过阅读材料可以很容易得到答案：广南市舶（即市舶使），得居停十三行（即十三行）。这类题型比较容易做答，但是许多同学都会犯同一个错误，就是照抄材料，这样答题在高考中是规定不给分的，所以学生要注意一定不要照抄材料的原文。

1 材料和方法

1.1 细胞

HL-1细胞（小鼠心房肌细胞）（武汉普诺赛生命科技有限公司）。

1.2 主要试剂

1.3.3 CCK-8检测细胞存活率 取对数生长期细胞，按6×10/孔细胞接种于96孔板，过夜贴壁后，对照组置于5%CO细胞培养箱中正常培养，实验组经不同OGD时间处理后，各组细胞按CCK-8 试剂盒说明书，加入CCK-8反应液，于37 ℃孵箱中孵育1 h，酶标仪450 nm波长检测吸光度值。

1.3.9 透射电镜观察线粒体形态 0.25%胰酶消化收集各实验组细胞，PBS液冲洗2次，之后向细胞内加入3%戊二醛，固定1 h，PBS液冲洗2次，再向细胞内添加1%锇酸固定1 h，丙酮酸梯度脱水；包埋，超薄切片，铀铅双染色；透射电子显微镜拍片。

1.3 主要方法

1.3.5 qPCR 检测ACTB mRNA、TUBA mRNA 水平按照RNA 提取试剂盒说明书提取HL-1 细胞的总RNA。标准化各组RNA浓度，反转录为cDNA后进行扩增，以7SL为内参照，用2法计算ACTB mRNA以及TUBA mRNA的相对表达量。ACTB的上游引物序列为：5'-AAG GCC AAC CGC GAG AAG AT-3'，下游引物序列为：5'-ACA GCC TGG ATA GCA ACG TAC A-3'；TUBA 的上游引物为：5'-TCT GTG AAA CTG GTG CTG GA-3'；下游引物序列为：5'-AGT GAC CAC GGG CAT AGT TGT T-3'；7SL的上游引物序列为：5'-ATC GGGTGT CCG CAC TAA GTT-3'，下游引物序列为：5'-CAG CAC GGG AGT TTT GAC CT-3'。

若块内的灰度值大于阈值T，则把该点的值置为1，否则将该点的值置为0，将图像二值化能更进一步减少图像中的信息量，减少无关信息的干扰。将灰度图像二值化后结果见图2。

1.3.2 OGD实验模型建立 根据参考文献［5］的方法，将对数生长期的HL-1细胞接种于60 mm培养皿中，于第2天将已贴壁细胞更换为无糖无血清培养基并置于缺氧培养箱中（1%O、94%N、5%CO、37 ℃），按照实验需求培养不同时间后用于随后的实验。实验进行如下分组：正常组（Control）、氧糖剥夺组（OGD）、NC-siRNA组（转染乱码RNA）、PNPT1-siRNA 组、OGD+NCsiRNA组和OGD+PNPT1-siRNA组。

MEM 培养基（Procell）；胎牛血清（Gibco）；0.25%胰蛋白酶（Gibco）；RNA提取试剂盒和反转录试剂盒及SYBR(TaKaRa)；qPCR引物由成都擎科伟业生物科技有限公司合成；PNPT1 抗体（Proteintech）；PNPT1 siRNA三条序列和对照序列由成都擎科伟业生物科技有限公司合成；脂质体Lipofectamine 2000 (Invitrogen)；ɑ-Tubulin抗体（Affinity）；Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒（Solarbio）；JC-1 试剂盒（Solarbio）；山羊抗兔II 抗（Solarbio）；ECL发光液（Millipore）。

1.3.4 细胞PNPT1 siRNA转染 将细胞悬液置于孔板中，细胞生长至约40%密度时，按照试剂使用说明用Lipofectamine 2000作为转染试剂以50 nmol/L浓度进行PNPT1 siRNA转染或对照载体转染，每组设置3个复孔。

1.3.1 HL-1细胞培养 小鼠HL-1细胞的培养基成分：10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的MEM培养基，置于5%CO、37 ℃培养箱中孵育。随后每2 d更换培养液，待细胞生长融合至约90%时，用0.25%胰酶消化后按照1∶3传代培养。选择对数生长期的细胞进行实验。

1.3.6 Western blot 检测细胞PNPT1的表达 按照蛋白提取说明书提取HL-1细胞蛋白，用BCA蛋白定量法测定各组蛋白浓度。按20 μg总蛋白量上样，SDS-PAGE分离蛋白，转印至PVDF膜，5% BSA中室温封闭1.5 h。加入相应的I抗（PNPT1按1∶2000稀释），4 ℃摇床孵育过夜。次日回收I抗，TBST洗膜3次，10 min/次，加入II抗（1∶5000）室温孵育1 h。再次TBST洗膜，与ECL发光液充分反应后扫描显影。Image J软件分析结果。

qPCR结果显示，OGD诱导引起了ACTB和TUBA mRNA的降解（图4A、C，＜0.05）。利用siRNA敲减PNPT1表达后发现与NC-siRNA+OGD组相比，siRNA1+OGD组ACTB 和TUBA mRNA降解被抑制（图4B、D，＜0.05）。

1.3.8 JC-1检测线粒体膜电位 将各组细胞用胰酶消化，PBS重悬，2000 r/min下离心5 min，重悬于500µL细胞培养液中；按照JC-1线粒体膜电位水平检测试剂盒说明书，制备反应缓冲液备用，吸取500µL的JC-1工作液将细胞均匀悬浮，置于培养箱内20 min，取出细胞，2000 r/min离心5 min，加入稀释好的反应缓冲液洗涤2次，再用500µL JC-1染色缓冲液（1×）重悬细胞，用流式细胞仪分析结果。

市盈率(PE)：是最常用来估计股价水平是否合理的指标之一。投资股票是对上市公司未来发展的一种展望，如果某股票具有较高的市盈率，代表市场预测未来的盈利增长速度快，说明投资者情绪高昂，该股票被追捧。反之，如果整体市盈率偏低，说明投资者兴趣不高。

周期分割后，每个脉搏波持续时间较短，可视单个脉搏波的基线漂移是沿一条直线产生的。在单个脉搏波信号中，本文令基线漂移方程为y(n)=an+b，n为样本编号；a、b表示系数，其可通过该脉搏波的A点和E点求出。令A点和E点坐标分别为(x1,y1)和，则基线漂移方程为。再令单个脉搏波信号序列为Pr(n)，将Pr(n)减去y(n)的对应项，得到基线校准后的序列Po(n)，如式（3）所示。式中i=0,1,···,N-1，N表示当前脉搏波的样本数。

1.4 统计学处理

采用SPSS20.0软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，＜0.05为差异有统计学意义。

宝宝总有一天是要自立于社会的，如果能从小培养宝宝自己的事情自己做、自己的东西自己管、自己的生活自己安排的“自我管理”习惯，就能增强宝宝行动的独立性、目的性和计划性。这对于宝宝今后生活的幸福和成功无疑是有巨大的帮助的。

2 结果

2.1 OGD诱导HL-1心肌细胞凋亡损伤

引入siRNA在OGD条件下敲减PNPT1表达，敲减效率验证试验结果显示PNPT1-siRNA1效率最高（图3A，＜0.05），且siRNA敲减可以有效降低胞质PNPT1蛋白含量。敲减PNPT1后，利用流式细胞术检测HL-1心肌细胞OGD诱导下的凋亡情况，结果显示，未予以OGD诱导时PNPT1敲减未明显影响HL-1心肌细胞凋亡，而予以OGD诱导后PNPT1敲减明显降低了细胞凋亡水平（图3B，＜0.05）。

2.2 OGD诱导增加HL-1心肌细胞胞质PNPT1含量

Western blot结果显示，随着OGD诱导时间延长，HL-1心肌细胞胞质中PNPT1的蛋白水平呈上升趋势，且在诱导16 h节点PNPT1蛋白水平最高，这与OGD诱导HL-1心肌细胞凋亡的趋势一致（图2，＜0.05）。

2.3 PNPT1敲低减轻OGD 诱导的HL-1心肌细胞凋亡

给予HL-1心肌细胞不同时间梯度OGD诱导后，利用CCK-8检测细胞存活率。结果显示，随着OGD诱导时间延长，HL-1心肌细胞存活率呈下降趋势（图1A，＜0.05），OGD诱导16 h心肌细胞存活率最低。在16 h诱导节点检测心肌细胞凋亡率显示细胞发生明显凋亡（图1B，＜0.05）。

2.4 PNPT1敲低减少OGD条件下凋亡相关mRNA降解

1.3.7 流式细胞术检测细胞凋亡率 将HL-1细胞按1×10/孔接种于6孔板中，贴壁后更换为无双抗培养液，同时加入PNPT1-siRNA1或NC-siRNA处理24 h后再OGD处理16 h，收集上清，用不含EDTA的0.25%胰酶消化收集细胞，PBS洗涤3次。按照Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒说明书进行染色，在1 h内用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。Flow Jo软件分析结果。

2.5 PNPT1敲低减轻HL-1心肌细胞OGD下线粒体损伤

利用JC-1检测线粒体膜电位，结果显示OGD可诱导线粒体膜电位下降，而敲减PNPT1后OGD诱导的线粒体膜电位下降得到部分逆转（图5A，＜0.05）。透射电镜结果显示，OGD诱导后线粒体形态发生明显变化，整体呈肿胀状态，内部电子密度降低，嵴消失，形成空泡结构；PNPT1敲减后线粒体形态得到明显改善，整体肿胀程度降低，内部可见完整的嵴结构（图5B）。

3 讨论

在动脉粥样硬化斑块等病理因素作用下，IHD患者心脏冠状动脉血流被限制，心肌处于慢性缺血条件下，导致心肌细胞凋亡，纤维组织增生，引起心肌重构，心脏功能降低和心律失常，甚至诱发死亡。研究发现，急性心肌梗死后梗死周围的区域有显著的心肌细胞凋亡，而且患者在急性心肌梗死后出现症状性心力衰竭与细胞凋亡率显著增加相关。因此，抑制心肌细胞凋亡，减少细胞数量损失被认为是预防IHD患者心脏损伤的重要策略，靶向mRNA治疗凋亡相关疾病及心血管疾病也是目前的研究热点。本研究聚焦于mRNA降解介导心肌细胞凋亡的新视角，基于OGD诱导HL-1心肌细胞构建的体外缺血模型，利用基因敲减技术探索了PNPT1介导的mRNA降解在心肌细胞缺血凋亡中的重要作用。本研究发现OGD下HL-1心肌细胞中PNPT1异常蓄积于细胞质，并引起mRNA降解和线粒体损伤；而敲减PNPT1后OGD诱导的mRNA降解、线粒体损伤和细胞凋亡均得到逆转。

我国会计法律法规对会计人员的职业行为和专业素质提出了更高要求，国家关于会计工作的相关法律法规，职业道德要求是每一名会计人员在日常工作中必须遵守的规范。通过对会计人员继续教育培训，确保会计队伍全面掌握最新的法律法规，以及对会计人员工作行为的要求。在全新的历史时期，我们应该充分认识到会计人员继续教育也是国家法律法规管理工作提出的新要求，是加强会计队伍有效管理的重要组成部分，更是加强会计人才队伍建设的重要内容。开展会计人员继续教育培训的目的是为了提高会计人员的政治素养、业务能力、职业道德水平，使其及时更新专业知识，补充和拓展专业素质。

mRNA代谢正常对细胞存活至关重要。作为蛋白合成模板，mRNA决定基因表达蛋白产物的最终氨基酸序列，一旦蛋白合成障碍，细胞的正常结构和功能将遭到破坏。而在细胞的正常生命活动中，mRNA的降解是必不可少的，其作用在于消除产生异常蛋白质的缺陷mRNA、终止该核糖核苷酸的循环和适应环境的变化。既往研究发现，哺乳动物细胞中mRNA和rRNA在早期凋亡反应中就发生降解，甚至早于DNA片段裂解。这一现象也在经典细胞凋亡途径中得到证实，在细胞凋亡早期就观察到广泛的mRNA 降解，并以ACTBTUBA等为代表的管家基因降解最为显著。显然，mRNA降解是细胞凋亡过程的关键环节，但其作用揭示较为局限，是否介导心肌细胞缺血性凋亡也尚不清楚。本研究以管家基因ACTB 和TUBA mRNA作为观察窗口，发现OGD诱导HL-1心肌细胞凋亡伴随mRNA降解增加，证实mRNA降解同样在心肌细胞缺血凋亡中发挥重要作用。

作为触发mRNA凋亡的核酸外切酶，PNPT1的酶活性发挥决定于其亚细胞定位。既往研究提示，HCT 116细胞中PNPT1细胞质异常蓄积诱发了广泛mRNA降解和细胞凋亡；而干预胞质中PNPT1水平可显著逆转这一过程。实际上PNPT1的生物学功能十分复杂，它既能促进某些mRNA的降解也在一部分mRNA的稳定维持中发挥作用。有研究在黑色素瘤细胞中过表达PNPT1后发现，PNPT1通过激活PKR-EIF2α通路进而下调抗凋亡蛋白BCL-X表达最终导致肿瘤细胞凋亡。此外，PNPT1还被证实通过降解原癌基因cmyc的mRNA使细胞周期停滞在G1期，导致细胞S期缩短而发生凋亡。本研究揭示了PNPT1在心肌细胞缺血凋亡中的重要作用，发现OGD下PNPT1异常蓄积于HL-1心肌细胞胞质并诱导mRNA降解及线粒体损伤，最终导致细胞凋亡。

综上所述，本研究基于OGD诱导HL-1心肌细胞构建的体外心肌缺血模型，初步揭示了PNPT1 介导的mRNA降解在心肌细胞缺血性凋亡中的重要作用。心房肌细胞缺血性凋亡一直被认为是缺血性心肌病心房重构的细胞基础，心房肌细胞丢失诱发的纤维化增生也是导致AF等心律失常的主要机制。我们在与人原代心房肌细胞具有相似分子反应的HL-1心肌细胞上验证的介导细胞缺血性凋亡的新机制将为缺血性心肌病的抗凋亡靶点开发提供理论基础。此外，我们进一步揭示了PNPT1介导mRNA降解对线粒体的损伤效应，这一发现进一步提示了mRNA降解在心肌细胞缺血性凋亡中的上游调控地位。