邓 鑫， 李瑛傑，2， 魏 蔚， 杨 焰， 马净植， 谢三祥△

1华中科技大学同济医学院附属同济医院口腔医学中心，武汉 430030 2华中科技大学协和深圳医院口腔科，深圳 518000

羟基磷灰石(hydroxyapatite，HAP)是人类骨组织和牙齿等天然硬组织组成部分中最稳定的磷酸钙，其具有优异的理化、生物性能，能与有机成分特异性结合[1]。而羟基磷灰石结合肽(hydroxyapatite binding peptides，HABPs)是指能识别并结合于HAP表面的生物活性肽。不少研究通过噬菌体展示技术鉴定HABPs，并研究其体外结合亲和力[2-3]。众所周知，HAP主要由Ca2+、PO43-组成，具有两性离子的特征，静电引力是导致HAP与蛋白质之间发生吸附最主要的一种作用力，而蛋白质分子往往带有一定量的电荷，所以pH值是一项重要的生理环境参数，对蛋白质在HAP表面的吸附具有重要影响[4]。我们前期通过噬菌体展示技术淘选目标HABPs时获得了一系列理想的HAP结合序列，因体外合成成品HABPs成本高、周期长，我们尝试利用M13噬菌体作为载体以噬菌体展示状态进行实验。本文报道了其中一条与HAP特异性结合力较好且解吸附特征对外界环境pH值改变敏感的HABPs序列YSLHWGE(YSL)，利用这种特质可结合抗菌药物制备口腔植入物的表面涂层，其可随着口腔唾液pH值改变释放抗菌药物，起到控制牙菌斑的效果，具有一定的临床应用前景。

1 材料与方法

1.1 实验设备及材料

羟基磷灰石生物陶瓷HAP(四川大学生物材料工程研究中心)；X射线衍射仪(德国Bruker AXS，D8-Focus)；倒置荧光显微镜(OLYMPUS，TH4-200，日本TOKYO)；摇床(天呈，T-100C)；电热恒温培养箱(上海精宏，DNP-9082)；生物安全柜(苏州智净，BHC1300 ⅡA/B2型)；数显恒温水浴锅(常州澳华，HH-4)；超声波清洗机(新芝生物科技股份有限公司，SB-3200DTD)；pH计(奥豪斯，STARTER3100)。

1.2 羟基磷灰石生物陶瓷HAP物相鉴定

采用X射线衍射(X-ray diffraction，XRD)对HAP样本进行物相分析。将试样磨成粉末，取适量制样后放置于X射线衍射仪的载物台上，连续扫描得到相对强度随着2θ变化的分布曲线，测试结果与羟基磷灰石的标准图谱比较分析。

1.3 单克隆噬菌体储液的制备及其展示肽序列的测定

利用噬菌体随机肽库对HAP进行筛选，经多轮生物淘选和选择、噬菌体扩增获得多组具有不同底物亲和力的多肽序列，其中YSLHWGE(YSL)通过滴定测量回收后的噬菌体数量显示对HAP的结合亲和力较高用于后续实验。取目标序列(YSL)和随机序列VTDSKPK(VTD)甘油存样各1 μL，梯度稀释到合适的倍数，于IPTG/Xgal蓝白筛选平板上培养。取单个蓝色噬菌斑进行扩增，测试扩增液滴度并提取噬菌体DNA测序(QIAprep Spin M13，New England Biolabs，USA)以确定产物序列的准确性。

1.4 HABPs单克隆噬菌体投入回收比初步鉴定HABPs亲和力

将载有目标序列YSL或随机序列VTD的单克隆噬菌体分别与HAP结合，通过滴定测量回收后的噬菌体数量，计算最初投入的噬菌体与回收液的噬菌体之间的比值以评价这2个结合肽序列对HAP的结合亲和力。随着噬菌体与底物结合亲和力的提高，噬菌体的投入回收比值变大。

1.4.1 载有YSL或VTD的单克隆噬菌体与HAP结合 配制pH=8.5的TBST缓冲液[含0.15(V/V)吐温20]用于本实验。依照常规洗脱方案，将底物HAP依次使用去离子水、无水乙醇、去离子水超声振荡5 min后高温高压灭菌40 min，再置于90℃ 10%氢氧化钠溶液中浸泡1 h后使用大量去离子水清洗HAP至中性，加入10 mL TBST缓冲液中37℃温和摇床过夜，吸取过夜液体加入封闭液1 mL，37℃温和摇床封闭1 h，吸取封闭液后使用TBST缓冲液清洗HAP数次，分别于管中投入等量1.2×1011pfu的目标肽序列YSL及随机肽序列VTD单克隆噬菌体，37℃温和摇床进行孵育1 h后吸去管中未结合的噬菌体，然后用10 mL新鲜配置的TBST缓冲液清洗多次以去除残余未结合的噬菌体，加入非特异性缓冲液1 mL 37℃温和摇床10 min后加入150 μL Tris-HCl缓冲液。通过滴度测试测得目标肽序列YSL和随机肽序列VTD用非特异性洗脱液洗脱的滴度结果，实验重复3次。

1.4.2 单克隆噬菌体滴定测试 挑选目标序列和随机序列的LB/Tet培养基平板上分离培养的宿主菌ER2738的单克隆菌斑，于含10 μL四环素的10 mL LB培养液中37℃剧烈振荡6～8 h培养至感染状态备用。同期微波融化顶层琼脂后分装于新鲜灭菌的离心管中，48℃温浴备用。将待滴度测试的噬菌体用LB培养液做适当的稀释后加入菌液快速混匀倒入新鲜配置的LB/IPTG/Xgal平板，室温静置3 min后倒置放入培养箱内37℃过夜培养。外膜蛋白上含有展示肽噬菌体能在LB/IPTG/Xgal平板上形成蓝色的噬菌斑。

计算大约含有100个噬菌体计数平板上蓝色噬菌体的数量，按照下列公式计算噬菌体的滴度：噬菌体的滴度(pfu/10 μL)=蓝色噬菌斑数量×稀释因子

1.5 免疫荧光法验证HABPs亲和力

通过免疫荧光技术再次验证2种结合肽与HAP的亲和力。取等量HAP粉高压灭菌消毒备用。用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的抗M13单克隆抗体(RL-ph2，sc-53005 FITC)对结合于HAP表面的噬菌体进行标定，对M13噬菌体-HABPs的亲和力进行半定量分析[5]。实验组分别为投入等量的目标肽序列和随机肽序列，以不加任何肽序列作为空白对照组，同时暴露于1 mL PBST缓冲液2 h，温和摇床。吸走目标序列组和随机肽序列组未结合的噬菌体后，3组样本同时加入200 μL FITC标记的抗噬菌体外壳蛋白pVⅢ的抗M13单克隆抗体避光温育1 h，最后用新鲜配置的PBST缓冲液洗涤5次。依次将等量粉末悬浮液转移到显微镜载玻片上，使用倒置荧光显微镜进行观察，使用Image J软件大致计算噬菌体颗粒表面被荧光覆盖面积，将荧光图像中噬菌体的覆盖面积与白光下图像中粉末的近似表面积进行比较[6]，得到粉末被荧光点亮的面积比值(荧光视野下的噬菌体覆盖面积/白光视野下的粉末面积)和其平均吸光度(A)值。

1.6 环境pH值变化对HABPs解吸附行为的影响

为了测定目标肽序列YSL与随机肽序列VTD在不同pH值TBST缓冲液浸泡洗脱1 h后的解吸附性能，配制pH值为8.5、7.5、6.5、5.5和4.5的TBST缓冲液(含0.15[V/V]吐温20)，依照常规洗脱方案，将底物HAP依次使用去离子水、无水乙醇、去离子水超声振荡5 min后高温高压灭菌40 min，再置于90℃ 10%氢氧化钠溶液中浸泡1 h后使用大量去离子水清洗HAP至中性，加入10 mL pH=8.5 TBST缓冲液中37℃温和摇床过夜，吸取过夜液体加入封闭液1 mL，37℃温和摇床封闭1 h，吸取封闭液后使用pH=8.5 TBST缓冲液清洗HAP数次，分别于管中投入等量2×1010pfu的目标肽序列YSL及随机肽序列VTD单克隆噬菌体，37℃温和摇床进行孵育1 h后吸去管中未结合的噬菌体，然后用10 mL新鲜配置的pH=8.5 TBST缓冲液清洗多次以去除残余未结合的噬菌体，再换新鲜配置的1150 μL pH=7.5 TBST缓冲液浸泡1 h后回收全部液体，再依次换用新鲜配置的1150 μL pH为6.5、5.5、4.5的TBST缓冲液重复上述操作回收浸泡液，最后再用1150 μL非特异性洗脱液洗脱并回收终末洗脱液。通过滴度测试测得目标肽序列YSL和随机肽序列VTD在这4组pH值(7.5、6.5、5.5、4.5)TBST缓冲液浸泡洗脱1 h后回收液及终末非特异性洗脱液的滴度结果，实验重复3次。

1.7 统计学分析

所有数据以均数±标准差表示，统计分析均使用GraphPad Prism 6.0软件进行。计量资料组间均数比较采用t检验的非配对双侧检验分析均值之间的差异，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 羟基磷灰石生物陶瓷HAP物相鉴定

从HAP的XRD图结果可得其与羟基磷灰石的(002)、(112)、(300)和(202)晶面的特征吸收峰匹配良好，表明粉末主要物相为羟基磷灰石。

2.2 HABPs单克隆噬菌体投入回收比初鉴HABPs亲和力

YSL和VTD噬菌体投入回收比结果显示，YSL噬菌体回收率为VTD噬菌体回收率的17.5倍，且差异具有统计学意义(P=0.0027)，表明YSL对底物HAP具有较强结合力。

2.3 免疫荧光法验证HABPs亲和力

为了进一步验证HABPs对HAP的亲和力，本研究通过免疫荧光技术分析FITC标记的YSL和VTD及空白对照组与HAP表面结合的荧光面积及强度。结果显示(图1)：YSL组HAP表面与荧光结合的面积比例显著高于VTD组与荧光结合的面积比例[(71.98±2.30)%vs.(49.95±2.28)%，P<0.01]，且YSL平均吸光度值同样明显高于VTD组[(0.10090±0.00544)vs.(0.04637±0.00117)，P<0.01]。这一数据与噬菌体投入回收比值结果一致，表明YSL与HAP表面结合亲和力显著强于VTD。

A：YSL、VTD及对照组免疫荧光实验图像；B：YSL、VTD及对照组HAP粉末荧光面积比；C：YSL、VTD及对照组平均吸光度结果；与YSL组比较，*P<0.05；与VTD组比较，#P<0.05图1 免疫荧光法验证HABPs亲和力Fig.1 Verification of affinity of HABPs by immunofluorescence assay

2.4 噬菌体单克隆测序

根据生工生物工程(上海)有限公司提供的噬菌体测序分析报告得到目标序列和对照组序列分别为YSLHWGE和VTDSKPK，并通过登录Novopro网站输入序列查询[5]得到其物理化学特性见表1。

表1 YSL、VTD序列的物理化学性质Table 1 Physical and chemical properties of YSL and VTD sequence

从表1我们可以得到YSL等电点<7，属于酸性氨基酸，包含1个带负电荷的碱性氨基酸Leu和1个带正电荷的酸性氨基酸Glu，整体带电量为0，呈中性；而VTD等电点>7，属于碱性氨基酸，包含1个带正电荷的酸性氨基酸Asp和2个带负电荷的碱性氨基酸Lys，整体带电量为-1，呈碱性；YSL和VTD的分子量分别为890.93 g/mol、773.87 g/mol，YSL和VTD的PI值经计算分别为5.14和9.88；另外，根据计算所得亲水性的总平均值，这2个肽序列均具有亲水性，且VTD较YSL更为亲水。

2.5 不同pH值缓冲液中HABPs的解吸附行为

为分析YSL和VTD于不同pH值缓冲液中在HAP表面的解吸附行为，我们对比两者在新鲜配置的pH=7.5、6.5、5.5、4.5 TBST缓冲液中依次浸泡1 h后各回收液的滴度测试结果(图2)，发现YSL在各pH值缓冲液中释放的噬菌体数量占原吸附总量的比例均明显高于VTD(均P<0.05)，表明在相同pH值缓冲液中YSL较VTD有明显的解吸附行为。同时我们还注意到，YSL在不同pH值缓冲液洗脱下释放的噬菌体数量也有差异(P<0.05)，表明其对生理环境pH值的改变反应敏感且明显。在pH=6.5缓冲液洗脱下释放的噬菌体数量最多，而后随着缓冲液pH值降低，回收液中的噬菌体数量逐渐减少。而VTD在不同pH值缓冲液中释放的噬菌体数量无明显差别。

与YSL组比较，*P<0.05；同组不同pH间比较：与pH=7.5比较，aP<0.05；与pH=6.5比较，bP<0.05；与pH=5.5，比较cP<0.05图2 YSL和VTD在不同pH值缓冲液洗脱后解吸附量占原吸附总量的比值Fig.2 The ratio of desorption capacity to total adsorption capacity of HABPs after elution in buffer with different pH values for both YSL and VTD

非特异性洗脱液回收YSL和VTD的滴度测试结果见图3，YSL噬菌体回收量明显高于VTD(P<0.01)，再次表明YSL对底物HAP亲和力高于VTD，与上述亲和力测试结果一致。

图3 YSL和VTD在终末非特异性洗脱液回收后滴度测试结果Fig.3 Titer test results of YSL and VTD after recovery of terminal nonspecific eluent

3 讨论

HAP作为一种重要的生物医学材料，在口腔医学领域有着广泛的应用，因其自身的复杂性使得其与多肽之间的作用机制一直都是该领域的研究难点。随着以噬菌体随机肽库与展示技术为代表的生物文库技术的出现，这一高通量的筛选与平台技术为研究HAP等生物材料与多肽相互作用的机制提供了可能和便利条件[7]。大部分研究通过噬菌体展示技术获得理想的肽序列之后往往会通过体外合成成品HABPs进行后续的实验，但人工合成HABPs往往存在成本高、周期长的问题，而噬菌体展示状态下的肽序列因噬菌体自身可增殖的生物特征可通过扩增的方法不断重复获得，具有成本低且周期短的优势。本研究直接使用通过噬菌体展示技术分离得到的一条对HAP表面有较强亲和力的新七肽序列YSLHWGE(即HABPs)，通过噬菌体滴度测试和免疫荧光实验鉴定出该序列较随机肽序列与HAP底物有更强的结合力。再利用不同pH值的TBST缓冲液(pH=7.5、6.5、5.5、4.5)作为洗脱液依次浸泡1 h，发现目标序列YSL较随机肽序列VTD更容易受环境pH值变化发生解吸附行为，具有一定的缓释能力。基于这一系列结果我们尝试探讨该结合肽序列有较高亲和力且具有敏感解吸附特征的原因，以期为深入理解蛋白在HAP表面的吸附行为提供参考。

HAP的表面很复杂，目前我们得知HAP等电点在pH=7左右，整体上偏中性，同时表面带有电荷[8]。而蛋白质的HAP界面吸附是一个十分普遍、非常复杂而又极其重要的现象，受材料和蛋白质的自身性质以及溶液环境等内外因素综合影响，其主要驱动力包括氢键、静电相互作用、疏水相互作用和范德华力等。除了蛋白质多肽链段上的自由氨基和羧基基团被认为是影响蛋白质界面吸附的主要因素外，蛋白质多肽链段的氨基酸组分和序列也被认为对蛋白质的界面吸附有主导作用[9]。同时有研究表明，吸附体系中pH值的改变能够调节HAP的表面电荷量，进而改变HAP与蛋白质分子之间静电作用的类型和强度[10]。

HAP表面有2种不同类型的结合位点，分别为带正电的C位点(富含钙离子)和带负电的P位点(富含磷酸根离子)，被认为是蛋白质在HAP表面的结合位点并提供蛋白质吸附的主要驱动力；其中蛋白质的羧基基团和氨基基团分别结合带正电荷的C位点和带负电荷的P位点，C位点对负电荷的亲和力比P位点对正电荷的亲和力更强。除此以外，酸性氨基酸基团能够强烈地结合HAP表面的钙离子，这也是大多数富含γ-羧基化谷氨酸、聚谷氨酸以及磷酸化氨基酸等酸性氨基酸基团的非胶原类蛋白质或多肽可参与矿化过程的原因[10]。同时，除静电力外，疏水相互作用是诱导蛋白质表面亲和力增加的另一个重要途径。一般来说，疏水表面对蛋白质的吸附作用比中性荷电的亲水表面强，因为蛋白质的两亲结构中存在疏水的残基结构，通过疏水作用使蛋白质倾向于吸附在疏水表面[11]。因此具有疏水性的HAP本身对蛋白质就有一定的吸附能力。而经研究鉴定出来的目标肽序列YSLHWGE与随机序列VTD相比较含有酸性氨基酸Glu(谷氨酸)且位于序列末端，意味着序列末端有2个羧基能与HAP中C位点的Ca2+多一个相结合的位点，同时目标肽序列YSL其亲水性平均系数(GRAVY)大于随机组VTD，意味着目标肽序列YSL亲水性小于随机组VTD，与HAP的疏水作用更强。此外，有报道表明，较大的蛋白质有更多的结合位点与底物表面相互作用[11]。因此，较大的分子有可能被更多地吸附在表面上。所以从分子量对比，YSL可能比VTD有更多的结合位点，以上这些都有可能是YSL较VTD对HAP亲和力更强的原因。

生理环境是影响蛋白质吸附的重要因素，而pH值是影响生理环境中电学性能的重要参数。研究表明，pH值的降低会增加酸性蛋白的吸附。之前很多研究表明在不同pH值环境下，HAP表面Zeta电位均为负电位[12]，同时有报道表明，HAP颗粒对BSA的吸附能力随pH值增大而减弱[10]。原因是随着体系pH值增大，溶液中OH-浓度增大，HAP表面吸附OH-逐渐增多；而BSA蛋白分子等电点为4.7，在pH>pI时带负电荷，HAP与BSA之间存在静电斥力，使BSA分子难以扩散到HAP微粒表面发生吸附，导致BSA在HAP表面的吸附量逐渐减小。我们研究的YSL与BSA情况相似，等电点为5.14，所以当用pH大于pI的TBST浸泡1 h后，YSL因缓冲液中OH-浓度不同程度的增加从而带有不等量的负电荷，与HAP存在静电斥力而发生解吸附行为，导致释放在浸泡回收液中噬菌体数目增多。当用pH值(4.5)小于pI的TBST缓冲液浸泡1 h时，YSL带有少量正电荷，与HAP之间发生静电引力，因此对YSL的吸附量逐渐增加，此时释放到溶液中的噬菌体数量明显减少。此外，HAP的溶解度也是影响溶液性能的重要参数。研究表明[13]，HAP在缓冲液pH值降低过程中会伴随HAP的溶解，随着酸性加强，H+增多，HAP的溶解量随之加大，大量的羟基发生脱离并停留在HAP附近，加上Ca2+的远游破坏电中性以及磷酸根基团的脱离，使得HAP表面Zeta电位仍呈负电性，随着酸性再增加，脱离的羟基、磷酸基团和Ca2+数量进一步增加，则Zeta负电位绝对值又将有所增大。所以这两方面机制使得吸附于HAP表面带有目标肽序列YSL的噬菌体数量随着pH值降低而减少。

因此，我们可以利用这种解吸附特征随生理环境pH值改变的HABPs序列与某些抗菌物质相结合用作口腔植入物的表面涂层，在口腔唾液因进食等生理活动变化导致pH值改变时可释放该抗菌复合物，起到控制菌斑的效果，这将具有一定的临床应用前景。