王玎，李志英，李会，卢娇

1 三峡大学附属仁和医院妇科，湖北宜昌443001；2 三峡大学妇科肿瘤研究所

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，根据国际癌症研究机构发布的数据，2020 年全球卵巢癌新发病例约31.4 万例，死亡病例约20.8 万例［1］。在妇科三大恶性肿瘤中，卵巢癌的预后最差，其原因为卵巢癌位置深在，发病隐匿，临床确诊时多处于晚期，并且卵巢癌恶性程度高、易转移和复发。目前，卵巢癌的发病机制尚不完全清楚，至今仍缺乏有效的早期诊断方法。表观遗传学改变与正常的生理过程和疾病的发生、发展存在密切联系。DNA 甲基化是一种被广泛研究的表观遗传学修饰方式。有研究报道，抑癌基因异常甲基化在肿瘤进展过程中扮演重要角色［2-3］。钙黏蛋白13（CDH13）和原钙黏蛋白8（PCDH8）均为钙离子依赖性细胞黏附分子，可参与细胞间识别和黏附过程，与肿瘤细胞增殖、分化、迁移等生物学行为密切相关［4-5］。近年研究发现，CDH13 基因启动子甲基化与非小细胞肺癌和肝癌的发生、发展密切相关［6-7］，而PCDH8 基因启动子甲基化与前列腺癌和肾细胞癌的发生、发展密切相关［8-9］。但CDH13、PCDH8基因启动子甲基化与卵巢癌的关系尚不明确。本研究观察了CDH13、PCDH8基因启动子甲基化与卵巢癌患者临床病理特征和预后的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015 年1 月—2016 年6 月三峡大学附属仁和医院收治的卵巢癌患者203 例。所有患者经术后病理检查明确诊断。纳入标准：①符合卵巢癌诊断标准；②年龄≥18 岁；③初诊；④接受根治性或姑息性手术且术前未接受任何抗肿瘤治疗；⑤临床病理资料和术后随访资料完整。排除标准：①合并其他部位肿瘤者；②合并全身感染性疾病者；③合并心、肝、肾等重要脏器严重疾病者；④合并自身免疫性疾病者。患者年龄27～73（47.58 ±9.54）岁，其中≥55岁67例、＜55岁136例；肿瘤直径：

≥4 cm 119例，＜4 cm 84例；组织分化程度：低分化55例，中高分化148 例；TNM 分期：Ⅰ、Ⅱ期86 例，Ⅲ、Ⅳ期117 例；有淋巴结转移91 例，无淋巴结转移112例。本研究经三峡大学附属仁和医院伦理委员会批准（审批编号：20210016），患者或其家属知情同意并签署书面知情同意书。

1.2 CDH13、PCDH8 蛋白表达检测 采用Western blotting 法。将手术切除的卵巢癌组织及其配对的癌旁组织（距肿瘤组织边缘＞5 cm，经病理检查明确为正常卵巢组织），液氮中速冻。取冻存的卵巢癌组织与癌旁正常组织，剪碎后置于研钵中，液氮下充分研磨成粉末，加入RIPA裂解液提取组织总蛋白。经BCA 法蛋白定量合格后，加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸变性。取变性蛋白20 μg，SDSPAGE 分离。电泳结束，将蛋白电泳产物转印至硝酸纤维素膜上，室温封闭1 h 后，加入兔抗鼠CDH13、PCDH8、β-actin 一抗，4 ℃孵育过夜。次日，洗膜后加入FIFC 标记的山羊抗小鼠IgG 二抗，37 ℃孵育4 h。最后ECL显色，暗室中曝光、显影和定影。Tanon GIS-1000 数码凝胶图像分析系统分析各蛋白电泳条带灰度值。以β-actin 为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

1.3 CDH13、PCDH8基因启动子甲基化状态检测 采用甲基化特异性PCR 法。取冻存的卵巢癌组织与癌旁正常组织，剪碎后置于研钵中，液氮下充分研磨成粉末。采用基因组DNA 提取试剂盒抽提基因组DNA，亚硫酸氢钠修饰基因组DNA 后，分别采用CDH13、PCDH8 基因启动子甲基化引物与非甲基化引物进行扩增。引物序列由北京天根生化科技有限公司设计合成。CDH13 基因启动子甲基化引物：上游引物5′-TCGCGGGGTTCCTTTTTCGC-3′、下游引物5′-GACGTTTTCATTCATACACGCG-3′，非甲基化引物：上游引物5′-TTGTGGGGTTGTTTTTTGT-3′、下 游 引 物5′-AACTTTTCATTCATACACACA-3′；PCDH8 基因启动子甲基化引物：上游引物5′-CTTATAAAGGTAAAGGCGGC-3′、下游引物5′-AAATCAGGCTCATTACGAAC-3′，非甲基化引物：上游引物5′-GGTTAGAAAGGTAAAGGTGG-3′、下游引物5′-AAAATCACACTCTTTACAAA-3′。PCR 反 应 体系共20 μL：2×Taq PCR MasterMix 10 μL，DNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，RNase-free 6 μL；反应条件：94 ℃5 min，94 ℃45 s、60 ℃30 s、72 ℃30 s共40个循环，最后72 ℃5 min。取扩增产物5 μL，2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。Marker 选择DS2000，以甲基化酶处理的基因组DNA 作为阳性对照，以水代替DNA作为空白对照。甲基化阳性：甲基化引物扩增出目的条带，而非甲基化引物未扩增出目的条带；甲基化阴性：甲基化引物未扩增出目的条带，而非甲基化引物扩增出目的条带。

1.4 随访 所有患者出院后定期随访5 年，以患者死亡为终点，随访截至2021年6月或患者死亡，记录患者生存情况，计算5年累积生存率。

1.5 统计学方法 采用SPSS26.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，结果比较采用独立样本t检验。计数资料比较采用χ2检验。生存分析采用Kaplan-Meier 法，生存率比较采用Log-Rank检验。危险因素分析采用多因素Cox 比例风险回归模型。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 卵巢癌组织与癌旁正常组织CDH13、PCDH8蛋白表达比较 卵巢癌组织CDH13、PCDH8 蛋白相对表达量分别为0.56 ± 0.18、2.21 ± 0.54，癌旁正常组织分别为1.18±0.33、3.02±0.63。卵巢癌组织CDH13、PCDH8蛋白相对表达量均低于癌旁正常组织（t分别为-15.754、-11.666，P均＜0.01）。

2.2 卵巢癌组织与癌旁正常组织CDH13、PCDH8基因启动子甲基化状态比较 卵巢癌组织CDH13、PCDH8 基因启动子甲基化阳性率分别为62.56%（127/203）、75.86%（154/203），癌旁正常组织分别为8.87%（18/203）、7.88%（16/203）。卵巢癌组织CDH13、PCDH8基因启动子甲基化阳性率均高于癌旁正常组织（χ2分别为127.459、192.718，P均＜0.01）。

2.3 CDH13、PCDH8 基因启动子甲基化状态与卵巢癌患者临床病理特征的关系 见表1。

表1 CDH13、PCDH8基因启动子甲基化状态与卵巢癌患者临床病理特征的关系［例（%）］

2.4 CDH13、PCDH8 基因启动子甲基化状态与卵巢癌患者预后的关系 截至2021 年6 月，共随访5～60 个月、中位随访时间42 个月，随访期间死亡77 例。卵巢癌组织CDH13 基因启动子甲基化阳性患者5年累积生存率为56.69%，卵巢癌组织CDH13基因启动子甲基化阴性患者5 年累积生存率为71.05%，卵巢癌组织CDH13 基因启动子甲基化阳性患者5年累积生存率低于卵巢癌组织CDH13基因启动子甲基化阴性患者（χ2=11.087，P＜0.05）。卵巢癌组织PCDH8 基因启动子甲基化阳性患者5 年累积生存率为58.44%，卵巢癌组织PCDH8 基因启动子甲基化阴性患者5 年累积生存率为73.47%，卵巢癌组织PCDH8 基因启动子甲基化阳性患者5 年累积生存率低于卵巢癌组织PCDH8 基因启动子甲基化阴性患者（χ2=14.796，P＜0.05）。见图1、2。

图1 卵巢癌组织不同CDH13基因启动子甲基化状态患者的生存曲线

图2 卵巢癌组织不同PCDH8基因启动子甲基化状态患者的生存曲线

2.5 卵巢癌患者预后不良的影响因素分析 卵巢癌患者死亡者与存活者临床病理资料比较见 表2。

表2 卵巢癌患者死亡者与存活者临床病理资料比较［例（%）］

以卵巢癌患者预后（死亡=1，存活=0）为因变量，以年龄（≥55 岁=1，＜55 岁=0）、TNM 分期（Ⅲ、Ⅳ期=1，Ⅰ、Ⅱ期=0）、淋巴结转移（有=1，无=0）、CDH13 基因启动子甲基化状态（阳性=1，阴性=0）、PCDH8基因启动子甲基化状态（阳性=1，阴性=0）为自变量，纳入多因素Cox 比例风险回归模型。结果发现，TNM 分期Ⅲ、Ⅳ期及有淋巴结转移、CDH13 基因启动子甲基化阳性、PCDH8 基因启动子甲基化阳性均为卵巢癌患者预后不良的独立危险因素（P均＜0.05）。见表3。

表3 卵巢癌患者预后不良的多因素Cox比例风险回归分析结果

3 讨论

卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤，其发病率仅次于宫颈癌和子宫内膜癌，但其病死率却高居妇科恶性肿瘤首位。卵巢癌早期5年生存率超过90%，但卵巢癌早期症状不明显，约70%患者确诊时已处于晚期，而卵巢癌晚期5 年生存率仅30%左右［10-11］。目前，卵巢癌的发病机制尚不完全清楚，至今仍缺乏有效的早期诊断方法。表观遗传学是研究除DNA 序列变化外的其他机制引起的细胞表型和基因表达的可遗传改变，包括DNA 甲基化、组蛋白修饰、染色质结构重构、非编码RNA 调控等。表观遗传变异具有可逆性。因此，表观遗传学药物能够为恶性肿瘤提供新的治疗策略［2］。DNA 甲基化是一种被广泛研究的表观遗传学修饰方式。转录活跃基因启动子上游区域DNA 甲基化可导致选择性基因沉默，当抑癌基因沉默时可导致肿瘤发生，并能促进肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移等［12］。

CDH13 又称T-钙黏蛋白、H-钙黏蛋白，是非典型钙黏蛋白家族成员之一。CDH13 具有常见的钙黏蛋白细胞外区的所有特征，但缺少跨膜结构和典型的细胞质区序列，能够通过糖基磷脂酰肌醇锚定于质膜外表面，从而在细胞黏附、信号转导、细胞生长调控等方面发挥重要作用［13］。CDH13 广泛分布于正常细胞表面，但在多种恶性肿瘤细胞中表达下调甚至缺失，可作为抑癌基因参与恶性肿瘤的发生、发展［14-15］。XU 等［14］研究报道，胰腺癌组织CDH13表达显著下调，异种移植过表达CDH13 能够通过抑制Wnt/β-连环蛋白信号通路激活，抑制胰腺癌细胞增殖、侵袭和迁移。WANG 等［15］研究发现，乳腺癌和肺癌组织CDH13 基因启动子甲基化阳性明显升高，通过DNA 聚合酶β增强CDH13蛋白表达后，乳腺癌和肺癌细胞侵袭、迁移能力明显受到抑制。本研究结果发现，卵巢癌组织CDH13 蛋白相对表达量低于癌旁正常组织，提示在卵巢癌组织中CDH13 蛋白表达受到抑制。进一步研究发现，卵巢癌组织CDH13基因启动子甲基化阳性率明显高于癌旁正常组织，并且CDH13 基因启动子甲基化阳性与TNM 分期和淋巴结转移有关，进一步说明卵巢癌组织CDH13 基因高度甲基化，CDH13 蛋白表达受到抑制，并且CDH13 蛋白低表达与卵巢癌恶性进展有关。本研究结果还发现，卵巢癌组织CDH13 基因启动子甲基化阳性患者5年累积生存率低于卵巢癌组织CDH13基因启动子甲基化阴性患者，说明CDH13 基因启动子甲基化可能与卵巢癌患者预后有关；进一步通过多因素Cox 比例风险回归分析发现，CDH13 基因启动子甲基化阳性是卵巢癌患者预后不良的独立危险因素，提示CDH13 基因启动子甲基化有可能成为预测卵巢癌患者预后的生物标志物。

原钙黏蛋白是钙黏蛋白超家族中最大的一个亚群，PCDH8 为原钙黏蛋白家族成员之一。以往研究多关注PCDH8 与神经系统疾病的关系。近年研究发现，PCDH8 异常表达还与肿瘤的发生、发展密切相关［16-17］。孙良璋等［16］研究报道，肺癌组织PCDH8蛋白表达下调，而上调PCDH8蛋白表达能够通过抑制蛋白激酶B/糖原合成酶激酶-3β/β-连环蛋白信号通路激活，抑制肺癌细胞增殖、侵袭和迁移。YE等［17］研究发现，鼻咽癌组织PCDH8 蛋白表达下调，上调PCDH8 蛋白表达能够通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白信号通路激活，从而发挥抑癌作用。虽然上述研究并未分析肿瘤组织PCDH8基因启动子甲基化情况，但均发现肿瘤组织PCDH8 蛋白表达下调。近年谢小红等［18］研究报道，PCDH8 基因启动子甲基化与甲状腺乳头状癌的发生风险增加有关。本研究结果发现，卵巢癌组织PCDH8 蛋白相对表达量低于癌旁正常组织，说明卵巢癌组织PCDH8蛋白表达下调。进一步研究发现，卵巢癌组织PCDH8 基因启动子甲基化阳性率明显高于癌旁正常组织，并且PCDH8基因启动子甲基化阳性与TNM 分期和淋巴结转移有关，提示卵巢癌组织PCDH8基因高度甲基化，PCDH8蛋白表达受到抑制，从而促进卵巢癌恶性进展。本研究结果还发现，卵巢癌组织PCDH8 基因启动子甲基化阳性患者5年累积生存率低于卵巢癌组织PCDH8 基因启动子甲基化阴性患者，说明PCDH8基因启动子甲基化可能与卵巢癌患者预后有关；进一步通过多因素Cox比例风险回归分析发现，PCDH8 基因启动子甲基化阳性为卵巢癌患者预后不良的独立危险因素，提示PCDH8 基因启动子甲基化有可能成为预测卵巢癌患者预后的生物标志物。

综上所述，卵巢癌组织CDH13、PCDH8 基因启动子甲基化阳性明显升高，并且与肿瘤TNM 分期、淋巴结转移和患者预后密切相关。但本研究仅观察了卵巢癌组织CDH13、PCDH8基因启动子甲基化状态，二者在卵巢癌发生、发展中的具体作用机制尚不清楚，还需进一步研究。