成思源，杨文华，孙庚林

1 天津市北辰医院口腔科，天津300400；2 天津医科大学总医院口腔科

口腔癌是发生在口腔内恶性肿瘤的总称，其中90%以上为口腔鳞状细胞癌（OSCC）［1-2］。近年来，随着人民生活水平提高，吸烟、酗酒、咀嚼槟榔等不良生活习惯增多，以及人乳头瘤病毒感染增加，OSCC 的发病率不断上升。目前，外科手术仍然是OSCC 最有效的治疗手段，但术后复发和转移的风险较高，而现有的治疗策略对术后复发和转移的效果不佳［3］。因此，深入研究OSCC 发病的分子机制，探索新的分子治疗靶点，对改善患者预后意义重大。微小RNA（miRNA）是一类短链非编码小RNA分子，能够在转录后水平负向调控靶基因的表达。近年研究发现，miRNA 能够作为癌基因或抑癌基因参与肿瘤的发生、发展［4］。miR-31-5p是miRNA家族中的一员。有研究报道，miR-31-5p在结直肠癌和膀胱癌组织中异常表达，并且其异常表达与肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移密切相关［5-6］。大肿瘤抑制激酶2（LATS2）是一种能够抑制肿瘤发生、发展的激酶。有研究报道，LATS2 在非小细胞肺癌和乳腺癌组织中低表达，并且其低表达能够促进肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移［7-8］。但目前临床鲜见miR-31-5p、LATS2在OSCC 组织中表达的报道，并且其表达与患者临床病理特征和预后的关系尚不清楚。本研究探讨了OSCC 组织miR-31-5p、LATS2 表达变化及其临床意义。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2017年1月—2018年10月天津市北辰医院收治的OSCC患者97例。所有患者经术后组织病理检查明确诊断。纳入标准：①符合OSCC 诊断标准；②接受口腔癌根治术、下颌-唇劈开术或拉通术治疗；③初诊，术前未接受任何抗肿瘤治疗；④临床病理资料和术后随访资料完整。排除标准：①年龄＜18岁者；②合并其他部位恶性肿瘤者；③合并心、肝、肾等重要脏器严重疾病者；④合并全身感染性疾病者。其中，男65例、女32例，年龄36～78（58.25 ± 8.65）岁；肿瘤直径：≥3 cm 65 例，＜3 cm 32例；组织分化程度：低分化21 例，中高分化76 例；TNM 分期［9］：Ⅰ、Ⅱ期51例，Ⅲ、Ⅳ期46例；有淋巴结转移41例，无淋巴结转移56例。本研究经天津市北辰医院医学伦理委员会批准（伦理批号：2022022501），所有研究对象或其家属知情同意并签署书面知情同意书。

1.2 miR-31-5p、LATS2 mRNA 表达检测 采用RTqPCR 法。收集术中切除的OSCC 组织及其配对的癌旁组织（距肿瘤组织边缘＞5 cm，并经组织病理检查明确为正常口腔黏膜组织），液氮下速冻。取冻存的OSCC 组织及其配对的癌旁正常组织，液氮下充分研磨后，采用TRIzol 法抽提组织总RNA，经Nano-Drop 2000C 超微量分光光度计鉴定，提取的总RNA浓度和纯度合格。按PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）说明将总RNA 反转录为cDNA。反转录条件：42 ℃1 h，95 ℃5 min。以cDNA 为模板，按实时荧光定量PCR 试剂盒说明进行PCR 扩增。所有引物序列由武汉金开瑞生物工程有限公司设计合成。引物序列：miR-31-5p 上游引物5′-CCCTCGAGACATTTGAAAGCCATTAGACT-3′、下游引 物5′-GCGTCGACAGGTTGAGCGAGCGAAG-3′，U6 上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；LATS2 上游引物5'-AAGAGCTACTCGCCATACGCCTTT-3'、下游 引 物 5'-AGCTTTGGCCATTTCTTGCTCCAG-3'，GAPDH 上游引物5'-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3'、下 游 引 物5'-ACACATTGGGGGTAGGAACA-3'。PCR 反应体系共10.0 μL：5 × SYBR Premix Ex Taq 5 μL，cDNA 模板1 μL，上下游引物各0.2 μL，ROX参考染料0.2 μL，DEPC 处理水3.4 μL；反应条件：95 ℃预变性90 s，95 ℃变性30 s、63 ℃退火30 s、72 ℃延伸15 s共40个循环。扩增反应结束后，绘制熔解曲线，收集循环阈值（CT）数。以U6 或GAPDH为内参，采用2-ΔΔCT法计算miR-31-5p、LATS2 mRNA相对表达量。

1.3 miR-31-5p 与LATS2 的结合位点预测 通过https：//starbase. sysu. edu. cn/在线网站，预测miR-31-5p与LATS2的靶向结合位点。

1.4 随访 所有患者出院后通过门诊复查或电话形式定期随访3 年，随访截至2021 年10 月，统计患者生存情况，计算3年累积生存率。

1.5 统计学方法 采用SPSS26.0 统计软件。计量资料经Shapiro-Wilk 检验符合正态分布，以±s表示，结果比较采用独立样本t检验；计数资料比较采用χ2检验。相关性分析采用Pearson 相关分析法。影响因素分析采用多因素Cox 比例风险回归模型。生存分析采用Kaplan-Meier 法，生存率比较采用Log-Rank检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OSCC 组织与癌旁正常组织miR-31-5p、LATS2 mRNA 表达比较 OSCC 组织与癌旁正常组织miR-31-5p 相对表达量分别为3.258 ± 0.562、1.096 ± 0.220，LATS2 mRNA 相对表达量分别为1.216 ± 0.252、3.354 ± 0.449。OSCC 组织miR-31-5p 相对表达量高于癌旁正常组织，LATS2 mRNA 相对表达量低于癌旁正常组织（t分别为35.314、40.900，P均＜0.01）。

2.2 OSCC 组织miR-31-5p 表 达与LATS2 mRNA 表达的关系 经在线网站预测，miR-31-5p与LATS2存在靶向结合位点，见图1。Pearson 相关分析显示，OSCC 组织miR-31-5p 表达与LATS2 mRNA 表达呈负相关关系（r=-0.688，P＜0.01）。

图1 miR-31-5p与LATS2的靶向结合位点示意图

2.3 miR-31-5p、LATS2 mRNA 表达与OSCC 患者临床病理特征的关系 见表1。

表1 miR-31-5p、LATS2 mRNA表达与OSCC患者临床病理特征的关系

2.4 miR-31-5p、LATS2 mRNA 表达与OSCC 患者预后的关系 97 例OSCC 患者中，miR-31-5p 表达≥3.258 者55 例、miR-31-5p 表 达＜3.258 者42 例，LATS2 mRNA 表达≥1.216 者40 例、LATS2 mRNA 表达＜1.216 者57 例。 miR-31-5p 表 达≥3.258 者与miR-31-5p 表达＜3.258 者3 年累积生存率分别为60.00%、78.57%，LATS2 mRNA 表达≥1.216 者 与LATS2 mRNA 表达＜1.216 者3 年累积生存率分别为80.00%、59.65%。miR-31-5p表达≥3.258者3年累积生存率低于miR-31-5p表达＜3.258者，LATS2 mRNA表达≥1.216者3年累积生存率高于LATS2 mRNA表达＜1.216 者（χ2分别为5.829、6.616，P均＜0.05）。见图2、3。

图2 OSCC患者不同miR-31-5p表达者的生存曲线

图3 OSCC患者不同LATS2 mRNA表达者的生存曲线

2.5 OSCC 患者预后的影响因素分析 所有患者术后随访4～36个月，中位随访时间26个月，随访期间死亡31 例。OSCC 患者死亡者与存活者临床病理资料比较见表2。

表2 OSCC患者死亡者与存活者临床病理资料比较［例（%）］

以随访时间为时间变量，以OSCC 患者预后（存活=0，死亡=1）为因变量，以单因素分析中有统计学差异的指标为自变量，纳入多因素Cox 比例风险回归模型。结果显示，TNM 分期Ⅲ、Ⅳ期及有淋巴结转移、miR-31-5p 表达≥3.258 为OSCC 患者死亡的独立危险因素，而LATS2 mRNA 表达≥1.216 则为其独立保护因素（P均＜0.05），见表3。

表3 OSCC患者预后影响因素的多因素Cox比例风险回归分析结果

3 讨论

口腔癌是口腔颌面部常见的恶性肿瘤，其中90%以上为OSCC。OSCC是起源于口腔黏膜上皮并伴有鳞状分化的上皮性恶性肿瘤，患者预后主要取决于肿瘤临床分期。临床上60%以上的OSCC 患者确诊时已属晚期，并有10%～40%患者出现淋巴结转移或远处转移。尽管近年来广泛开展多学科综合治疗，在一定程度上延长了OSCC 患者的生存期，但晚期OSCC 患者5 年生存率仍不足50%［10-11］。因此，深入研究OSCC 发病的分子机制，探索新的分子治疗靶点，对改善患者预后意义重大。

miRNA 是一类长度为18～25 个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA，通过与mRNA 的3′非翻译区特异性结合，降解mRNA或阻碍其翻译，从而调控靶基因的表达。近年研究发现，miRNA能够作为癌基因或抑癌基因参与肿瘤的发生、发展［4］。已有研究报道，miR-770 能够靶向调节Sir2 相关酶类7/Smad4信号通路促进OSCC细胞侵袭和迁移［12］。miR-31-5p是miRNA 家族中的一员，基因定位于人染色体9p21.3。柴晶晶等［13］研究报道，miR-31-5p在结直肠癌细胞中表达下调，而上调miR-31-5p 表达则能抑制结直肠癌细胞增殖、侵袭并促进其凋亡。YU等［14］研究发现，miR-31-5p 在肺腺癌细胞中表达上调，并且miR-31-5p能够靶向下调特异性AT序列蛋白2而促进肺腺癌细胞上皮间质转化。由此可见，miR-31-5p可作为抑癌或促癌基因参与多种肿瘤的发生、发展。本研究结果发现，OSCC 组织miR-31-5p 相对表达量高于癌旁正常组织，并且OSCC 组织miR-31-5p 表达与肿瘤组织分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关，提示miR-31-5p 在OSCC 中发挥促癌基因作用，其表达上调能够促进肿瘤恶性进展。这可能与miR-31-5p能够增强肿瘤细胞线粒体活性有关。线粒体是细胞内能量生成的关键细胞器，在细胞新陈代谢、迁移、凋亡等过程中发挥重要作用。线粒体功能障碍是肿瘤发生、发展的重要原因［15］。王恩程等［16］研究发现，沉默miR-31-5p 能够通过破坏OSCC 细胞的线粒体活性，抑制OSCC 细胞增殖并诱导其凋亡。本研究结果显示，miR-31-5p表达≥3.258者3年累积生存率低于miR-31-5p 表达＜3.258 者；多因素Cox 比例风险回归分析显示，miR-31-5p 表达≥3.258 是OSCC 患者死亡的独立危险因素。结果提示miR-31-5p 表达与OSCC患者预后有一定关系。

LATS 是AGC 家族中的一种丝氨酸/酪氨酸蛋白激酶，C 端序列高度保守而N 端序列变化多样，其功能亦具有多样性。LATS2 是LATS 家族的重要成员，在各种组织中广泛表达，以肌肉和心脏中表达最高。LATS2 基因定位于人染色体13q11～12 区域，该区域与多种抑癌基因的早期杂合性丢失抑制有关，提示LATS2 可能是一种抑癌基因。近年研究报道，LATS2在非小细胞肺癌、卵巢癌等恶性肿瘤细胞中低表达，上调LATS2 表达能够抑制肿瘤细胞增殖、分化和迁移等［17-18］。本研究结果显示，OSCC 组织LATS2 mRNA 相对表达量低于癌旁正常组织，并且OSCC 组织LATS2 mRNA 表达与肿瘤组织分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关。提示LATS2在OSCC中发挥抑癌基因作用，LATS2 mRNA 表达降低可促进肿瘤恶性进展。这可能与LATS2 能够参与组成Hippo 信号通路有关。Hippo 信号通路上游膜蛋白受体作为胞外生长抑制信号的感受器，在感受到胞外生长抑制信号后可激活一系列激酶级联磷酸化反应，使下游Yes 相关蛋白（YAP）、具有PDZ 结合基序的转录共激活因子（TAZ）磷酸化，从而抑制肿瘤细胞增殖、分化、迁移等［19］。LATS2 拥有PPXY 基序，能够结合并磷酸化带有WW 结构域的YAP、TAZ，从而组成Hippo 信号通路，使YAP、TAZ 失去促癌作用［20］。本研究结果显示，LATS2 mRNA 表达≥1.216者3 年累积生存率高于LATS2 mRNA 表达＜1.216者；而多因素Cox 比例风险回归分析显示，LATS2 mRNA 表达≥1.216 是OSCC 患者预后的独立保护因素。结果表明，LATS2 表达与OSCC 患者预后密切相关。

本研究经在线网站预测发现，miR-31-5p 与LATS2 存在靶向结合位点；相关性分析发现，OSCC组织miR-31-5p 表达与LATS2 mRNA 表达呈负相关关系。提示miR-31-5p、LATS2 可能共同影响OSCC患者预后。YUAN等［21］通过双荧光素酶报告基因试验证实，miR-31-5p 能够靶向下调LATS2 表达使Hippo信号通路失活，从而促进OSCC 生长。由于肿瘤恶性程度高、伴有淋巴结转移、耐药性高等原因，晚期OSCC 患者术后预后较差，5 年生存率较低。本研究结果亦发现，TNM 分期Ⅲ、Ⅳ期和有淋巴结转移是OSCC患者死亡的独立危险因素。

综上所述，OSCC 组织miR-31-5p高表达、LATS2低表达，二者表达变化与肿瘤组织分化程度、TNM分期、淋巴结转移以及患者预后有关。但目前miR-31-5p 和LATS2 在OSCC 发生、发展中的具体分子机制尚不完全清楚，仍需进一步研究。